【摘 要】
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目的:应用基因工程方法构建抗人宫颈癌ScFv基因进行ScFv基因的原核表达,为制备其他基因工程抗体和宫颈癌早期诊断和早期治疗打下基础.方法:①采用RT-PCR方法、反向PCR和PCR方
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目的:应用基因工程方法构建抗人宫颈癌ScFv基因进行ScFv基因的原核表达,为制备其他基因工程抗体和宫颈癌早期诊断和早期治疗打下基础.方法:①采用RT-PCR方法、反向PCR和PCR方法扩增抗人宫颈癌抗体V<,L>、V<,H>基因片段.②构建抗人宫颈癌ScFv基因,并将ScFv基因插入到克隆载体PMD18-T和表达载体pCANTAB 5E中,进行测序鉴定.③将带有抗人宫颈癌ScFv外源基因的表达载体pCANTAB 5E分别转化到TG1和HB2151两个原核表达体系中,对转化细胞HB2151进行诱导表达,使其表达可溶性ScFv;对转化细胞TG1用M13K07辅助噬菌体进行援救,使其产生噬菌体展示性ScFv.④对表达的抗人宫颈癌可溶性ScFv和噬菌体展示性ScFv进行检测.⑤优化可溶性ScFv和噬菌体ScFv的表达条件并用SAS对产物初步纯化.结论:①利用反向PCR技术可以增V<,H>基因,避免简并碱基的出现,保证ScFv在基因构建过程中的准确性和稳定性,是扩增同源性差、复杂的未知基因的一个较好方法;②重叠延伸拼接PCR法,能相对准确的扩增出ScFv基因,可以减少错配机会,并节约成本.③经TG1表达体系产生的噬菌体展示性ScFv能自然折叠,有较好的亲和力.④经HB2151表达体系产生的可溶性ScFv,不需要体外进行复性、折叠,就有抗体亲和活性.该研究的结果为进一步构建双特异性ScFv和双功能ScFv基因创造了条件,提供了利用ScFv进行动物实验和体外实验的材料,为人宫颈癌是早期诊断和特异性治疗打下了基础.
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