论文部分内容阅读
组蛋白去乙酰化酶(Histone decetylase3，HDAC3)在调控软骨特异性基因的表达上起着重要的作用。本研究的目的即是阐明:miR-193b-3p(miR-193b)能否通过HDAC3调控软骨的分化和代谢过程，探索表观遗传学调控机制在软骨代谢中的作用。 实验方法:在人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)成软骨分化过程中观察miR-193b-3p等基因的表达趋势。应用白细胞介素1β（IL-1β）刺激初代人软骨细胞(Primer human chondrocytes，PHCs)，观察miR-193b-3p和HDAC3等基因的表达变化。对比人OA软骨和配对的正常软骨中miR-193b-3p和HDAC3的表达变化。分别在hMSCs和PHCs中，过表达和抑制miR-193b-3p的表达，观察成软骨特异性基因的表达变化。应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-193b-3p和HDAC3的直接结合作用。在PHCs中，应用染色质免疫共沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation assays，ChIP）研究miR-193b-3p对组蛋白H3的乙酰化的调控作用。用HDAC抑制剂曲古抑菌素A(TSA)分别刺激hMSCs和PHCs，研究组蛋白乙酰化在软骨的分化和退变中的作用。为了在体内研究miR-193b-3p对PHCs的作用，在PHCs中敲低或过表达miR-193b-3p，再将转染后的PHCs种植在三磷酸钙-Ⅰ型胶原-透明质酸材料(Tricalcium phosphate-TypeⅠ Collgen-hyaluronan，TCP-COL-HA)中，然后将复合PHCs的TCP-COL-HA种植入裸鼠背部皮下，进行裸鼠背部皮下软骨组织工程材料种植实验。另外，分别提取正常和OA患者血液中的外泌体，检测miR-193b-3p的表达。 实验结果:miR-193b-3p在成软骨分化和肥大期的hMSC中表达升高。与正常的软骨相比，miR-193b-3p在OA软骨中表达显着降低。此外，双荧光素酶报告基因实验结果提示:miR-193b-3p抑制了含有HDAC3的3’-UTR构建体的荧光酶素强度，抑制了HDAC3的表达，促进了COL2A1，AGGRECAN，COMP和SOX9启动子相关区域的组蛋白H3乙酰化。HDAC抑制剂曲古抑菌素A(TSA)可增加PHCs中软骨特异性基因的表达和促进hMSC成软骨分化。TSA还能增加PHCs中AGGRECAN的表达，并降低经IL-1β处理的PHCs中的MMP13的表达。此外，在裸鼠皮下种植复合PHCs的TCP-COL-HA支架后8周，与对照组相比，miR-193b-3p的过表达可促进体内组织工程软骨的形成。我们还发现，与非OA人群相比，OA患者的血浆外泌体中miR-193b-3p表达水平显著降低。 研究结论和意义:以上结果表明miR-193b-3p可直接靶向HDAC3，促进组蛋白H3乙酰化，从而在表观遗传学层面上调控PHCs的代谢和hMSC的成软骨分化过程。研究为解决软骨组织工程中MSCs成软骨分化效率低、分化后易退变这一难题提供了一种新的思路。