论文部分内容阅读
天然免疫分子TRIM5α(tripartite motif protein5α)是近年来发现的一种重要的宿主细胞内逆转录病毒限制因子。在灵长类动物细胞中,TRIM5α蛋白可以在病毒进入细胞后、逆转录前的阶段抑制HIV-1、N-MLV和EIAV等逆转录病毒的复制。由于TRIM5α分子的作用,绝大部分日大陆猴(Old World monkey)都不能感染HIV-1。而在新大陆猴(New World monkey)中,鹰猴是唯一不感染HIV-1的灵长类动物。研究证明,鹰猴细胞中存在的TRIM5-CypA融合蛋白(owlmonkey TRIM5-CypA,omTRIMCyp)介导了抗HIV-1的作用,从而使鹰猴不能感染HIV-1。研究证明,平顶猴是旧大陆猴中唯一报道可以感染HIV-1的灵长类动物,但是其感染HIV-1的机制并不清楚。
根据现行的灵长类动物分类学,原属平顶猴群体(M.nemestrina group)的三个亚种分为猕猴属的三个不同种:巽他平顶猴(Sunda pig-tailed macaque,M.nemestrina),北平顶猴(Northern pig-tailed macaque,M.leonina)和明打威猴(Mentawai macaque,M.pagensis)。本论文对中国云南境内北平项猴TRIM5基因座和感染HIV-1的相关性进行了研究。通过PCR和测序对北平顶猴基因组TRIM5基因座进行分析,发现一个CypA假基因的cDNA通过逆转座机制插入至TRIM5基因座的3-UTR区域,形成了一个不同于鹰猴TRIM5-CypA的新型融合基因npmTRIMCyp(northern pig-tailed macaque TRIM5-CypA)。通过RT-PCR对npmTRIMCyp融合基因的转录本进行分析,我们鉴定出npmTRIMCyp共有3种不同的选择性剪接产物,分别为npmTRIMCypV1-V3。进一步克隆和测序这3种不同选择性剪接体,通过丰度和序列分析证实:npmTRIMCypV2是优势剪接体,可能在该融合基因产物的功能中发挥作用。研究发现北平顶猴npmTRIMCyp融合基因主要转录本中外显子7和8均被剪切掉。外显子7剪接丢失机制源于TRIM5第6内含子内3剪接位点的G/T突变。
我们克隆了npmTRIMCyp融合基因cDNA的蛋白编码区ORF,并构建了重组表达npmTRIMCyp的载体,转染HeLa和HeLa-T4细胞并获得稳定表达的细胞株。通过感染HIV-1证实,npmTRIMCyp融合蛋白不能够限制HIV-1的感染和复制,这可能是北平顶猴作为旧大陆猴中唯一对HIV-1易感的灵长类动物的重要分子机制之一。通过HIV-1感染灵长类动物PBMCs实验证实,北平顶猴可以感染HIV-1。npmTRIMCyp可以有效地限制HIV-2ROD的复制,但对SIVmac239只有十分微弱的限制活性。通过构建鹰猴omTRIMCyp和北平顶猴npmTRIMCyp的置换剪接体(SWAP-1和SWAP-2),转染融合基因及其置换剪接体的CRFK细胞激光共聚焦实验证明,npmTRIMCyp、SWAP1和SWAP2在细胞内主要存在于胞浆中。稳定表达融合蛋白和置换剪接体的CRFK细胞感染HIV-1-GFP-VSVG分析表明,含omTRIMCyp外显子7的SWAP-1和SWAP-2均具有限制HIV-1活性,但SWAP-1的活性更强一些,这表明TRIM5结构域的外显子7可能在介导对HIV-1的限制活性中发挥了协同辅助作用。免疫共沉淀研究表明,npmTRIMCyp不能识别和结合HIV-1的衣壳蛋白。对北平项猴中介导识别逆转录病毒区域的基因组部分进行了测序,共鉴定出46个多态性位点,表明在北平顶猴识别逆转录病毒衣壳区域存在较高的多态性。