研究背景骨关节炎（osteoarthritis,OA）作为一种退行性关节疾病在临床上十分常见,常导致患者关节疼痛、活动受限甚至肢体残疾。OA发病机制复杂,但是作为一种累及整个滑膜关节的炎性疾病已是共识,而炎症的起始及循环扩大的过程尚不清楚。近年研究表明,OA的病因有可能来自软骨下骨,始发于软骨下骨的轻微炎症,在没有干预的情况下继续引发了软骨的炎症,然后不断的形成了炎症的正反馈循环,最终导致OA的各种病理和临床表现。如果能够在其炎症早期阻断这种循环,即可能够大大延缓OA的进程。生理状态下,关节软骨和软骨下骨之间缺乏交流,处于截然不同的两种微环境中。关节软骨内无血供,乏氧;软骨下骨血供丰富,有氧。钙化软骨层（calcified cartilage zone,CCZ）是位于关节软骨与软骨下骨之间的一层致密的界层结构,与毗邻组织连接处形成标志型的线性结构,即软骨侧的潮线（tide mark,TM）和骨侧的粘合线（cement line,CL）。钙化软骨层拥有的特殊形貌结构、组成成分赋予了钙化层独一无二的力学特性,使得关节在运动过程中,来着软骨的巨大力学冲击在钙化层得以衰减,还能够将来自软骨的剪切力变为压应力往软骨下骨传递。除此之外,钙化层还具有重要的屏障作用,这种屏障作用的缺失将开启了骨—软骨之间非正常的对话机制,其结果是引发了OA。然而,我们对于这一领域知之甚少,既往研究结果充满争议。因此,我们首先运用了各种技术手段以及模型来探索钙化层的屏障功能。但是要彻底明白钙化层的各种功能,还需要从钙化层的发生、发育的着手,从而过渡到理解病理状态下其重塑的机制。在钙化层形成过程中,我们认为软骨组织也经历了一个类似的软骨内成骨的过程,但是这一过程和完整的软骨内成骨又有一定的区别。无论如何,在软骨—骨（钙化层）转换过程中,软骨细胞肥大化、凋亡与转分化是软骨内骨化进程中的重要一环。大量证据表明,电压依赖性钙通道（voltage-dependent calcium channel,VDCC）广泛表达在骨软骨发育的各个阶段,并且这种时空特异性的分布对于骨软骨发育具有决定性作用。据此,本课题首先设计了一系列新的实验方案及技术手段,用于探查钙化层的通透性,旨在揭开钙化层的通透性在软骨发育,以及发生OA时的变化特点。然后以电压依赖型钙离子通道为切入点,进一步探究钙化层发育、重塑的分子机制。实验方法第一部分:原位观测活体小鼠关节成熟/不成熟钙化层的通透性1.1-8月龄小鼠钙化层组织学观察24只Balb/c雌性小鼠（1-8月龄,3只/月龄）,二氧化碳处死后对膝关节样本常规组织学处理,然后进行苏木精-伊红（HE）染色、番红O/固绿染色,显微镜拍照观察。Image J软件测算小鼠软骨厚度（软骨表面至潮线的距离）,钙化层的厚度（潮线至粘合线的距离）2.小鼠固定装置设计制造采用L型不锈钢板,在合适的位置安装两个机械臂。一个固定小鼠大腿,另一个固定自制的穿孔塑料培养皿。小鼠膝关节股骨髁暴露后穿过培养皿小孔,周围用胶水封闭。3.活体小鼠钙化层通透性观察实验84只Balb/c雌性小鼠分为未成熟钙化层组（1月龄,42只）和成熟钙化层组（6月龄,42只）,用罗丹明B溶液和四甲基罗丹明异硫氰酸葡聚糖溶液（TRITC-葡聚糖）作为示踪剂进行通透性测试。然后将动物分为4个亚组:成熟CCZ+罗丹明B、成熟CCZ+TRITC-葡聚糖、未成熟CCZ+罗丹明B、未成熟CCZ+TRITC-葡聚糖。扩散时间为1min、15min、30min、1h和2h。直接处死小鼠取下膝关节股骨远端样本（0min）作为空白对照,而股骨远端浸泡在罗丹明B或TRITC-葡聚糖中72h作为阳性对照。4.硬组织不脱钙荧光观测技术以及图像处理收集小鼠膝关节样本以后依次进行如下处理:冻干脱水、塑料包埋、切割打磨、共聚焦显微镜扫描、DAPI和荧光素钠复染、共聚焦显微镜二次扫描、两次扫描图像拟合。最后进行荧光值定位定量分析以及统计检验。第二部分:基于Mirco-CT和菲克定律观测人膝骨关节炎软骨钙化层的通透性1.OA样本收集和预处理根据纳入、排除标准,入选重度膝骨关节炎患者3例,待全膝关节置换手术完成后,立即用冰盒转移样本,根据关节软骨表面情况,钻取直径8mm的骨软骨柱（0-1级或者4级）。软骨下骨为基底面置入放入离心管,UV树脂胶进行密封、紫外线照射凝固,测试防水性。2.Mirco-CT扫描和图像分析于离心管内滴加0.5ml碘海醇,立刻放入Mirco-CT内进行高精度扫描。第一次扫描完成后,放入4℃冰箱内。以第一次扫描时间点为0h,然后在6h、24h、48h、72h再次进行扫描。扫描获得各时间点图像数据用3D slicer以及AMIRA软件进行3D重建,测算样本的CT值。3.扩散系数计算与数学建模根据菲克定律建立数学模型,解方程组求得解析解,不断将每个时间点距离——CT值带入方程,与实验数据相拟合,求出关节软骨及钙化层的扩散系数k。第三部分:在小鼠钙化层发育过程中软骨细胞T-VDCC表达特异性1.1-8月龄小鼠膝关节组织样本切片1-8月龄小鼠膝关节取材、常规石蜡包埋切片。2.小鼠膝关节标本免疫组化染色观察对不同发育阶段的小鼠膝关节样本切片行各亚型T-VDCC和软骨细胞肥大化、骨化相关标志蛋白免疫组化染色,拍照观察,计算阳性细胞率和细胞数量。第四部分:抑制Cav3.3后软骨细胞肥大化/成骨分化的分子机制1.小鼠原代关节软骨细胞分离、提取、体外培养培养,ATDC5软骨细胞系培养选用出生7-10天的Balb/c小鼠,二氧化碳处死后分离、提取、体外培养关节软骨中的软骨细胞。P2代小鼠软骨细胞用于实验处理和相关检测。ATDC5细胞系采用同样培养条件,进行体外培养扩增。2.小鼠原代软骨细胞、ATDC5软骨细胞系T-VDCC表达鉴定两种细胞进行T-VDCC三种亚型（Cav3.1,Cav3.2,Cav3.3）免疫荧光染色和western blot检测,明确三种亚型在这两种细胞中的表达情况。3.不同浓度Mibefradil抑制T-VDCC后对ATDC5软骨的影响在正常贴壁培养的ATDC5软骨细胞培养基中加入浓度为1μm、5μm、10μm、15μm的Mibefradil,48h后采用流式细胞仪行凋亡检测,阿尔新蓝、茜素红、碱性磷酸酶细胞染色、免疫荧光染色和western blot检测,查看不同浓度的Mibefradil抑制T-VDCC后,ATDC5细胞的凋亡情况,Cav3.1,Cav3.2,Cav3.3表达情况,以及软骨表型和肥大化表型蛋白标志物表达情况。4.si RNA抑制ATDC5细胞Cav3.3表达后细胞受到的影响根据三种亚型在ATDC5细胞中的表达情况,采用Cav3.3-si RNA转染正常贴壁培养的ATDC5细胞,抑制Cav3.3的表达,48h后行RT-PCR检测,确认Cav3.3是否被敲低;转染72小时以后进行流式细胞仪凋亡检测,阿尔新蓝、茜素红、碱性磷酸酶细胞染色、免疫荧光染色和western blot检测,查看Cav3.3表达降低以后,ATDC5细胞凋亡情况以及软骨表型和肥大化表型,成骨标志蛋白标志物表达情况。实验结果:第一部分:原位观测活体小鼠关节成熟/不成熟钙化层的通透性1.6月龄小鼠膝关节钙化软骨层发育成熟1-5月龄小鼠膝关节发育欠成熟,潮线不明显,各结构（软骨层、钙化软骨层和软骨下骨）层次边界不清。6月龄小鼠膝关节基本发育成熟,各个组织层次分界明显,潮线、粘合线清晰可见。7月、8月龄小鼠发育进一步成熟,软骨下骨结构更加致密。2.成熟的钙化层对罗丹明B有阻滞作用,未成熟钙化层则没有罗丹明B（476 Da）在成熟钙化层组的软骨层扩散达到饱和浓度的时间是30 min;在未成熟钙化层组的软骨层扩散达到饱和浓度的时间是1h。在体扩散2h后,发育成熟钙化层组,潮线以下没有罗丹明B的荧光,而未成熟钙化层组则能检测到。3.成熟钙化层对TRITC-葡聚糖具有阻滞作用,未成熟钙化层则没有对于成熟钙化层组和未成熟钙化层组,TRITC-葡聚糖（20k Da）在软骨层达到饱和浓度的时间分别未30 min和1h。扩散2h后,未成熟钙化层组软骨下骨有低浓度TRITC-葡聚糖分布,提示TRITC-葡聚糖通过未成熟钙化层组织向软骨下骨渗透,而成熟钙化层组则难以检测到TRITC-葡聚糖。第二部分:基于Mirco-CT和菲克定律观测人体骨关节炎钙化层的通透性1.4级OA钙化层与正常钙化层相比结构改变,通透性增加Micro-CT扫描提示,4级OA钙化层于0-1级相比,孔隙率增加,厚度也增加。在72h渗透以后,4级OA软骨下骨出现CT值增强,提示造影剂到达软骨下骨,但是正常组织软骨下骨增强不明显。2.OA进程中钙化层扩散系数改变通过数据和数学模型推算,0-1级OA钙化层扩散系数为0.03±0.01μm2/s,而4级OA钙化层扩散系数为0.12±0.04μm2/s。意味着发生4级OA时,软骨和骨之间的物质交换更容易。第三部分:在小鼠钙化层发育过程中软骨细胞T-VDCC表达特异性1.T-VDCC在小鼠钙化层成熟过程中的表达逐步下降随着小鼠膝关节发育,深层软骨组织（钙化层形成区域）逐渐钙化,软骨细胞Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3的表达都逐渐下降,与之伴随的是COL 10和成骨标志蛋白osteocalcin在该区域的持续高表达。而表中层软骨细胞中Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3持续表达,不随月龄增加而改变;COL 10、osteocalcin、MMP 13只有1月2月龄有阳性表达,之后随着月龄增长,不再表达。第四部分:抑制Cav3.3后软骨细胞肥大化/成骨分化的分子机制1.原代小鼠关节软骨细胞和ATDC5细胞中主要表达Cav3.3亚型原代原代软骨细胞和ATDC5细胞Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3免疫荧光染色显示,两种细胞Cav3.3都出现很强的荧光,而Cav3.1、Cav3.2荧光则几乎不可见。三种离子通道western blot提示,Cav3.3条带清晰可见,而Cav3.1、Cav3.2几乎没有条带。2.Mibefradil抑制ATDC5细胞中Cav3.3的表达培养基中加入1μm、5μm、10μm、15μm的Mibefradil以后,PCR结果提示随着浓度增加,Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3表达都下降,Cav3.3趋势最明显。western blot提示同样的结果,但是Cav3.1、Cav3.2同样的没有条带,Cav3.3表达其中在10μm浓度时最为显著,同免疫荧光结果一致。3.Mibefradil促进ATDC5细胞凋亡,软骨表型丢失并出现肥大化、成骨倾向培养基中加入1μm、5μm、10μm、15μm梯度浓度的Mibefradil以后,随着抑制剂浓度增加,流式细胞仪检测提示ATDC5细胞早期凋亡比例增加,阿尔新蓝染色变浅,而茜素红和ALP成骨标志染色则上升。western blot提示随着抑制剂浓度升高,COL 2、SOX 9、ACAN表达下降,COL 10、MMP 13、RUNX 2表达升高,其中5μm、10μm最为显著。培养基中加入10μm Mibefradil以后,免疫荧光染色提示COL 2、SOX 9表达下降,而COL 10、MMP 13、RUNX2表达上升。提示VDCC被抑制以后,ATDC5软骨表型丢失,出现成骨倾向。4.si RNA转染ATDC5细胞以后Cav3.3表达下调,软骨细胞表型改变,出现肥大化以及成骨分化倾向。构建Cav3.3-si RNA进行成功转染后,PRC,western bolt,免疫荧光染色提示ATDC5细胞中的Cav3.3表达出现下调。转染后,流失细胞仪检测示早期凋亡比例增加,阿尔新蓝、茜素红、碱性磷酸酶染色提示软骨表型丢失,表现成骨分化倾向。免疫荧光染色和western blot提示,COL 2、SOX 9表达下降,COL 10、MMP 13、RUNX2表达升高。5.抑制Cav3.3后软骨细胞表现成骨分化倾向依赖osteocalcin/NFAT途径ATDC5细胞Cav3.3表达下调后,免疫荧光和western blot提示其COL 1、非磷酸化NFATc2表达显著升高,osteocalcin,磷酸化NFATc2表达稍微升高,提示这种成骨倾向是Calcineurin/NFAT依赖途径。结论:1.小鼠出生后6月龄关节钙化层发育成熟,成熟的钙化层具有屏障功能。2.重度OA钙化软骨层重塑过程中,孔隙率增加和扩散系数增高,易化了关节软骨和软骨下骨之间的物质交换。3.小鼠钙化层在逐渐钙化成熟过程中,该区域软骨细胞T型电压依赖型钙离子通道表达逐渐下降,而肥大化、骨化表型蛋白表达上升。4.Cav3.3能促进软骨表型维持,抑制其功能和表达以后,ATDC5细胞出现Calcineurin/NFAT信号通路依赖的肥大化和成骨分化倾向。