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背景和目的新兴诊疗方法在肿瘤学领域取得了令人瞩目的突破性进展,但胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）患者的预后仍然不容乐观,其中位生存时间约为14.5～16.6个月。采用抗血管生成药物如单克隆人源化血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）抗体贝伐单抗（Bevacizumab,BEV）促进肿瘤血管正常化（Tumor vascular normalization,TVN）是被给予厚望的抗肿瘤治疗策略。抗血管生成治疗（Anti-angiogenic therapy,AAT）诱导的TVN效应能够重塑肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）,为联合其他抗肿瘤治疗提高治疗增效提供了一个机会时间窗。然而,血管正常化效应短暂,需要探索新的治疗策略增强延长AAT诱导的TVN效应,以期能够改善现有TVN诱导策略,持续提高对抗肿瘤治疗的协同增效作用。无创监测肿瘤治疗响应从而准确识别TVN效应有利于在正常化时间窗内正确指导抗肿瘤治疗实施和对治疗增效作用的评价。动态对比增强磁共振成像（Dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging,DCE-MRI）定量参数Ktrans能够定量评价血管功能特征,已被北美放射学会定量影像生物标志物联盟推荐作为评价AAT疗效的终点指标。体素内不相干运动磁共振成像（Intravoxel incoherent motion-MRI,IVIM-MRI）由于可同时定量评价组织微循环和组织间水分子弥散特征,且不依赖外源性钆对比剂（Gd-based contrast agent,GBCA）成像近年来受到了越来越多的关注。作为不同定量MRI技术,联合DCE-MRI与IVIM-MRI各自的成像优势有助于提供更丰富的血管功能信息。探究DCE-MRI和IVIM-MRI对肿瘤治疗响应监测和TVN评价的应用价值具有重要临床意义,有助于促进TVN策略的临床转化和应用。在本研究中,我们建立原位人源GBM移植瘤（Patient-derived xenograft,PDX）小鼠模型,探究靶向抑制VEGF和糖酵解激活因子PFKFB3的联合疗法是否能够协同增强TVN效应,并以DCE-MRI和IVIM-MRI监测肿瘤治疗响应的动态变化,分析MRI定量参数与TVN指标的相关性。材料与方法1、本研究首先采用GEO数据集GSE39221分析BEV治疗前后U87-MG GBM组织PFKFB3表达水平,随后建立224例原位GBM PDX小鼠模型,将其中172例PDX模型随机分为BEV单一治疗组、3PO（PFKFB3抑制剂）单一治疗组、BEV+3PO联合治疗组和安慰剂（生理盐水）对照组。采用7.0T临床前磁共振成像仪、免疫印迹和组织学染色对PDX模型进行肿瘤大小、PFKFB3表达水平、细胞增殖与凋亡和生存期评价,分析不同治疗干预方案对GBM的抗肿瘤作用。在治疗前基线、治疗后2天、5天、8天、14天、25天对PDX模型进行组织病理学和1H-磁共振波谱（1H-magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS）分析,评价肿瘤血管形态学特征、肿瘤缺氧程度、乳酸脱氢酶-A（Lactate dehydrogenase-A,LDHA）表达水平和肿瘤代谢物浓度。采用盐酸多柔比星（Doxorubicin hydrochloride,DOX）作为化疗药物对52例PDX模型进行不同治疗干预（DOX、DOX+3PO、DOX+BEV、DOX+BEV+3PO）,评价DOX在瘤内的富集程度和抗肿瘤作用。采用血管生成相关因子蛋白芯片、免疫印迹和生物信息学分析评价治疗相关的分子表达特征。2、采用7.0T临床前磁共振成像仪在治疗前基线、治疗后2天、5天、8天、14天、25天对已建立的172例PDX模型进行DCE-MRI和IVIM-MRI扫描,采用肿瘤区域分割和直方图方法分析肿瘤治疗响应的动态变化,并以影像-组织学指标相关性分析探讨MRI定量参数评价TVN的价值。结果1、GEO数据集分析结果显示U87-MG GBM组织PFKFB3水平在BEV单一治疗后显著增高。此结果在GBM PDX模型中得到一致验证。蛋白免疫印迹结果进一步显示PFKFB3靶向抑制剂3PO能够有效抑制BEV单一治疗诱导的PFKFB3表达增高,并显著增强BEV的抗肿瘤作用。BEV+3PO联合治疗较BEV单一治疗显著延长了荷瘤鼠生存期（68.5天vs.81天,P（27）0.05）,延缓了肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖。组织学染色分析表明BEV与3PO的协同抗肿瘤作用得益于持续的TVN增效作用。TVN指标周细胞覆盖指数（Pericyte coverage index,PCI）和基膜标志物collagen IV表达在双靶向联合治疗后2天显著增加,此增高现象持续至治疗后第25天,显著长于BEV单一治疗诱导的TVN效应（治疗后2～14天,P（27）0.05）。双靶向治疗诱导的TVN协同增效作用持续提高了对缺氧、酸性TME的重塑作用,肿瘤缺氧标志物哌莫硝唑和LDHA表达水平显著降低（P（27）0.05）。1H-MRS进一步发现肿瘤代谢物胆碱峰、脂质峰和乳酸峰明显降低（P（27）0.05）。此外,BEV+3PO治疗诱导的TVN协同增效作用显著改善了DOX的药物递送效率和疗效（P（27）0.05）,BEV+3PO治疗组中肿瘤区域DOX的富集程度较BEV单一治疗组更加明显,肿瘤生长抑制作用和荷瘤鼠生存期显著延长（P（27）0.05）。分子机制上,双靶向治疗下调了多种促血管生成因子的表达水平。其中,作为调控TVN过程的关键因子,肿瘤细胞和内皮细胞中的Tie-1表达水平在BEV+3PO处理后显著降低。2、DCE-和IVIM-MRI定量参数显示BEV+3PO诱导的肿瘤治疗响应异质性显著降低,肿瘤区域分割和直方图分析结果表明肿瘤中心区和外周区MRI参数变化均较BEV单一治疗组更加显著（P（27）0.05）。MRI定量参数与TVN指标相关性结果表明,DCE-MRI参数Ktrans、IVIM-MRI参数f和D*与肿瘤微血管密度和TVN指标相关关系均显著（P（27）0.0001）,Ktrans与微血管密度相关程度最高（r（28）0.7202,P（27）0.0001）。D*与PCI、collagen IV表达和肿瘤缺氧相关系数r分别为0.6365,0.6628,-0.5446,高于Ktrans（r分别为-0.5214,-0.5781,0.4656）。D*与Ktrans相关程度较弱（r（28）-0.4499,P（27）0.0001）。结论1、原位GBM PDX模型中,双靶向VEGF和PFKFB3治疗策略能够协同增强对GBM的抗肿瘤作用和TVN效应,进而持续改善缺氧、酸性TME,可为提高化疗增效提供一个持续的机会时间窗。此策略有利于克服目前TVN效应短暂的局限性,或可作为一个有希望的TVN诱导策略。2、IVIM-MRI参数D*具有很大潜力作为非外源性GBCA依赖的影像标志物有效补充DCE-MRI参数Ktrans评价肿瘤治疗响应TVN效应,有助于促进TVN治疗策略的临床转化及应用,对TVN时间窗内实施治疗决策提供了有价值参考指标。