【摘 要】
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本研究通过细胞内显微注射观察细胞间荧光染料转染的dye coupling 方法测定角膜基质细胞间缝隙连接功能的活性,结果表明角膜基质细胞间存在功能的缝隙连接,TNF-α以剂量依赖
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本研究通过细胞内显微注射观察细胞间荧光染料转染的dye coupling 方法测定角膜基质细胞间缝隙连接功能的活性,结果表明角膜基质细胞间存在功能的缝隙连接,TNF-α以剂量依赖关系抑制角膜基质细胞缝隙连接。应用特异性抗体通过免疫荧光和免疫印迹分析方法观察角膜基质细胞缝隙连接蛋白Cx43 的表达,结果表明Cx43 于细胞间相互连接的细胞膜部位呈点状染色。免疫印迹分析结果显示角膜基质细胞未添加任何刺激,细胞裂解产物行免疫印迹分析,可检测到4 个Cx43 条带,分子量分别相当于43、47、48、49kDa;添加TNF-α与角膜基质细胞共同培养,显著减少Cx43-P1 , Cx43-P2 , Cx43-P3 ,Cx43-NP 并没有增加,表明TNF-α不仅影响Cx43 的磷酸化,还影响Cx43 量的表达。应用定量逆转录聚合酶链反应测定角膜基质细胞缝隙连接蛋白Cx43 mRNA 的变化的结果显示,TNF-α对角膜基质细胞Cx43 mRNA 的量无显著影响。表明TNF-α在转录后水平下调角膜基质细胞Cx43 的表达。本文还利用角膜基质细胞三维胶原凝胶培养模型,观察了多核白细胞弹性蛋白酶及IL-1α对角膜基质细胞胶原降解作用。结果显示弹性蛋白酶直接降解I 型胶原,但对角膜基质细胞胶原降解无明显影响,同时添加弹性蛋白酶和IL-1α,明显增加角膜基质细胞胶原降解。明胶酶谱和免疫印迹分析显示,在无任何刺激的条件下,角膜基质细胞只产生MMP-2,添加IL-1α诱导角膜基质细胞产生MMP-1、MMP-3、MMP-9 ,添加多核白细胞弹性蛋白酶能转化MMP-1、MMP-3、MMP-9 为活化的片断。
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