基于亚铁离子诱导秘鲁鱿鱼蛋白抗氧化肽仿生微胶囊的研究

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本研究以秘鲁鱿鱼为原材料,首先通过复合酶解手段制备鱿鱼抗氧化肽,再利用膜分离设备分离出不同分子量的抗氧化肽,以人体所需微量元素之一的Fe2+对抗氧化肽进行螯合制备鱿鱼蛋白抗氧化肽亚铁仿生微胶囊,以下简称Fe(Ⅱ)-SAPMC,改变螯合时肽的浓度和螯合体系的pH,探究自组装微胶囊的微观结构和粒径分布以及热稳定特性,最后通过构建体外模拟消化模型对制备的微胶囊进行活性测定和微观结构变化的鉴定。主要研究结论如下:1)以秘鲁鱿鱼鱼糜为原材料,研究了木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶复合酶解对酶解肽亚铁螯合能力和抗氧化性的影响,并采用响应面法探究最佳复合酶解工艺。结果显示,以亚铁螯合率和DPPH·自由基清除率为评价指标,单酶酶解肽的亚铁螯合率和DPPH·清除率比复合酶解肽的低。再研究pH以及复合酶添加方式对酶解肽抗氧化性以及亚铁螯合能力的影响时发现,当先添加木瓜蛋白酶酶解一段时间后再添加碱性蛋白酶并控制木瓜蛋白酶pH为7,碱性蛋白酶pH为8.5时,效果最好。进一步以pH、酶添加总量以及酶添加配比为因素,亚铁螯合能力和DPPH·自由基清除率为响应值,通过响应面法获得了最佳的酶解工艺,结合实际实验操作调整酶解工艺为:木瓜蛋白酶pH 7.00,碱性蛋白酶pH 8.42,酶添加总量11800 U/g底物,两酶添加配比0.69(即木瓜蛋白酶:碱性蛋白酶=3.41%:4.96%)。此条件下酶解肽的亚铁螯合能力56.35%,DPPH清除率64.32%,为进一步利用鱿鱼抗氧化肽提供了工艺支持。2)进一步采用超滤膜分离法对鱿鱼鱼糜抗氧化肽进行分级分离,并采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证了其分离效果。以不同分子量、不同抗氧化肽浓度和螯合pH为变量,研究了鱿鱼抗氧化肽与亚铁离子自组装成微胶囊时的亚铁离子螯合能力,同时制备出鱿鱼抗氧化肽亚铁微胶囊,命名为Fe(Ⅱ)-SAPMC,并通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜、傅里叶红外光谱以及纳米电位粒径分析仪对Fe(Ⅱ)-SAPMC进行结构表征,同时利用差示量热法研究了热稳定性。结果显示:从SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图来看,超滤膜分离效果较好,能获得五组肽组分(>10 kDa、5~10 kDa、3.5~5kDa、1~3.5 kDa、<1 kDa)的鱿鱼抗氧化肽。不同分子量的鱿鱼抗氧化肽分别与亚铁离子螯合,发现<1 kDa的螯合率最高。改变螯合体系pH以及肽浓度发现,当螯合pH为7.0、肽浓度为3%时有最大的螯合率。进一步分析Fe(Ⅱ)-SAPMC的结构可知,不同分子量自组装成微胶囊的形态不一,多为数层重叠在一起,内部结构不清晰,推断为中空结构。其中5~10 kDa以及3.5~5 kDa分子量的螯合肽能较好地自组装成球形微胶囊,也有类似蚕茧结构,平均粒径分别为300nm。傅里叶红外光谱图表明了亚铁离子与肽发生了螯合,主要的螯合位点为羧酸基团中化学键(包括C=O键和—OH键)以及氨基中酰胺键,Fe(Ⅱ)-SAPMC的二级结构多为β-折叠。从螯合前后的差示扫描量热结果来看,Fe(Ⅱ)-SAPMC的变性温度和熔融温度均比原肽要高,说明了微胶囊存在较好的耐热性。3)通过构建模拟人体口腔唾液消化、胃液消化以及肠道消化模型,以羟自由基清除率、DPPH·清除率以及超氧阴离子自由基清除率为指标,研究了Fe(Ⅱ)-SAPMC在模拟胃肠道消化前后的抗氧化活性变化,探究了其耐酸性和耐胆盐性,并对消化前后的微胶囊进行微观结构和粒径表征。结果表明:经过人体胃肠道消化后各分子量微胶囊的抗氧化活性均有所下降,且分子量越小,受到的影响越大。在低pH的胃酸环境中孵育90min后,抗氧化活性下降较为明显,特别是分子量为5~10 kDa的微胶囊而在高胆盐的肠道环境中微胶囊表现一定的缓释性能。通过扫描电子显微镜结果图发现,经过模拟消化后微胶囊形貌较均一且趋向球状,粒径变小,平均粒径为100nm,推测在消化过程中,在消化液的作用下,Fe(Ⅱ)-SAPMC会进行二次自组装,其中的机制需要更进一步的探究。
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