钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体引起的在全球广泛流行的人兽共患疾病。其中问号钩端螺旋体是最主要的致病性钩体,它在污染的土壤、水和不同的宿主之间穿梭时,经历温度、pH、渗透压等多种条件的改变。因此钩体应该具备完善的胞外信号转导系统,可以通过感知胞外环境变化调整自身的生理代谢以适应变化的环境。Cyclic di-GMP(c-di-GMP)是一种新发现的细菌第二信使,可以通过感知信号的变化调控细菌的诸多生理行为比如细胞周期、毒力、生物的形成、运动性和趋化性等等。二鸟苷酸环化酶(diguanylatecyclases,DGC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDE)分别负责细菌 c-di-GMP 的合成与降解。c-di-GMP 通过与受体分子结合导致受体分子空间结构和活性改变,进而影响受体参与的代谢活动,导致激活或者抑制因子下游基因的转与表达,从而影响细菌的生理代谢活动。本研究中,我们运用生物信息学方法系统性分析了 15种钩端螺旋体c-di-GMP代谢相关酶的分布及进化情况,结果发现15种钩端螺旋体基因组中都含有大量的c-di-GMP合成酶和降解酶基因,表明在钩体中c-di-GMP是一个非常重要的第二信使。鉴于问号钩端螺旋体是国内主要流行的致病性钩体种类,因此我们深入分析了问号钩端螺旋体赖株56601的c-di-GMP信号通路。结果发现问号钩体基因组中含有25个c-di-GMP代谢相关基因,分别编码13个GGDEF结构域蛋白,3个GGDEF-EAL结构域蛋白,5个EAL结构域蛋白和4个HD-GYP结构域蛋白,且大部分c-di-GMP代谢酶与信号感知结构域相耦联。运用双荧光报告质粒系统检测问号钩体c-di-GMP代谢相关基因的酶活性,结果显示大部分DGCs和PDEs具有合成或降解c-di-GMP的能力。当我们分别删除LA1483基因的GAF信号感知结构域和LA2932基因的PAS信号感知结构域后发现LA1483和LA2932蛋白失去合成c-di-GMP的能力,表明PAS和GAF结构域对DGCs蛋白执行合成酶功能非常重要。而我们删除LA2528基因的REC结构域序列后发现其仍然可以合成c-di-GMP。当问号钩体从28°C培养条件转移至37℃培养条件时,HPLC-MS/MS测量钩体c-di-GMP含量发现,c-di-GMP水平下降,real-time PCR检测发现c-di-GMP代谢相关基因的表达模式多样化。通过real-time PCR检测c-di-GMP代谢相关基因的mRNA相对表达丰度,发现大部分的基因表达量非常低,而LA1483基因表达量非常高,几乎是其他基因的几百倍。当问号钩体感染小鼠J774A.1细胞后,HPLC-MS/MS检测发现,问号钩体胞内c-di-GMP水平下降,然而real-time PCR结果显示感染期间似乎并不影响c-di-GMP代谢相关基因的表达。此外,通过EMSA实验我们鉴定出了两个能与问号钩体能够c-di-GMP发生结合的PilZ结构域蛋白。钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体引起的再现性人兽共患病,全世界每年有将近50万份该病例报告。疫苗接种是预防和控制钩体病的最有效的措施。目前广泛应用的钩体疫苗还是灭活的钩体全菌疫苗。然而钩体全菌疫苗表现短时间免疫原性,副作用,血清群特异性明显等缺点,使得该疫苗的应用受到极大的限制。因此,开发一种通用的、高效力的和低毒性的钩体疫苗显得尤为急切。钩体外膜蛋白(Outer Membrane Proteins)OMPs,位于菌体表面,直接参与细菌与宿主的相互作用,且在不同血清型中比较保守,使得其成为目前钩体病疫苗开发的热点,但仍不能克服其血清群特异性免疫的特点。本实验中我们根据之前实验筛选和鉴定的钩体外膜蛋白OmpL1,LipL21和LipL32中的六个优势T-细胞和B-细胞联合抗原表位肽序列人工合成一条六表位肽联合DNA序列。通过DNA重组技术将六表位肽DNA序列串联四次,合成一条四重复的六表位肽融合序列,简称为r4R,并且克隆至pET28a表达载体中。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测显示重组质粒很好地表达了目的蛋白,且诱导表达的蛋白以可溶性形式存在。Western bolt实验证实r4R重组蛋白可以与钩体抗血清反应。通过MAT(Microscopic agglutination tests)检测r4R抗血清的交叉免疫反应,发现r4R抗血清可以与国内流行的主要血清型钩体产生凝集反应,表明r4R疫苗可能具有交叉保护效果。ELISA检测r4R抗血清发现IgG1和IgG2a水平明显升高,且IgG2a>IgG1。添加r4R刺激经r4R疫苗免疫后的小鼠脾细胞,经CCK-8试剂盒检测发现显著性促进脾细胞的增殖。ELISA检测脾细胞培养上清液发现IFN-γ水平明显升高。这些结果表明r4R疫苗倾向诱导Th1细胞免疫。在钩体攻毒实验中,我们发现免疫r4R疫苗后显著提高豚鼠的存活率,而PBS对照组的豚鼠则全部死亡。HE染色观察组织病变情况,r4R免疫的豚鼠各组织没有明显的病理改变,而PBS对照组豚鼠各组织均出现明显的病理改变。