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卵母细胞玻璃化冷冻在优良家畜种质资源保存、胚胎工程研究以及人类辅助生殖中越来越被广泛应用。但是,玻璃化冷冻-解冻过程中,卵母细胞要经历剧烈的环境应激,造成卵母细胞DNA甲基化降低、DNA损伤和细胞超微结构损伤,对卵母细胞的复苏、受精和胚胎发育带来了不利影响。本研究根据课题组的前期研究发现,卵母细胞冷冻引起卵母细胞解冻后甲基化水平总体下降。为了解析卵母细胞冷冻引起甲基化水平降低的原因,通过利用免疫荧光染色技术、qRT-PCR技术、RNAi等,检测在玻璃化冷冻-解冻过程中,主动去甲基化TET 1/2/3蛋白变化以及5-mC和5-hmC的动态变化。同时利用两种小分子活性调控剂和siRNA对检测变化最明显的TET3蛋白活性和表达进行调控,研究TET3蛋白在玻璃化冷冻-解冻过程中对DNA甲基化和羟甲基化的影响。得到以下研究结果:1、玻璃化冷冻-解冻0h、1h、2h后检测5-mC和5-hmC水平,两者水平在2h得到显著降低;同时,在玻璃化冷冻-解冻过程中,TET1/2在这个过程中不会发生显著变化(P>0.05),而TET3在2h时却得到显著增加(P<0.05)。随后在玻璃化冷冻-解冻后0h,1h,2h通过qRT-PCR检测TET相对基因表达,TET1相对基因表达量没有发生显著变化(P>0.05);TET2和TET3相对基因表达量在解冻复苏前期没有显著变化,在2h时检测,两者相对表达量得到显著提升(P<0.05)。2、在卵母细胞玻璃化冷冻和复苏过程中添加VC,2h后检测5-mC和5-hmC以及TET3基因表达变化。相对于未处理组,VC处理组不能显著提升TET3基因和蛋白表达水平和降低5-mC和5-hmC水平(P>0.05)。同样在DMOG处理整个玻璃化冷冻和复苏过程中,与VC处理相似,DMOG不能显著影响TET3基因和蛋白表达和提高玻璃化冷冻之后MⅡ卵母细胞5-mC和5-hmC水平(P>0.05)。GV期显微注射TET3 siRNA,体外成熟培养至MⅡ期,实施玻璃化冷冻。结果显示,TET3基因表达水平得到显著抑制(P<0.01),干扰组与未干扰组之间,5-mC水平并未发生显著变化(P>0.05),5-hmC水平得到显著提升(P<0.05)。结论:玻璃化冷冻MⅡ期卵母细胞会造成DNA甲基化和羟甲基化水平显著下降,同时在三种TET蛋白中,TET3在玻璃化冷冻后的MⅡ期卵母细胞中的相对基因表达水平和蛋白表达水平会显著上升。TET蛋白激活剂VC和抑制剂DMOG并不能够改变TET3的相对基因表达和蛋白表达,因此玻璃化冷冻之后的MⅡ期卵母细胞DNA甲基化和羟甲基化水平也不会发生显著变化。通过TET3 siRNA能够影响玻璃化冷冻之后卵母细胞的DNA羟甲基化水平,使MⅡ卵母细胞羟甲基化水平显著提升。