【摘 要】
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肺癌居恶性肿瘤致死的首位,诸多肺癌患者在诊断时已处于病情晚期。对于晚期肺癌患者,药物治疗是其主要治疗方法。在众多药物治疗策略中,抗血管生成治疗和免疫调控点治疗（免疫治疗）因其高效、低毒的特点,近年来逐步被广泛应用于肺癌治疗。临床研究发现,抗血管生成治疗和免疫治疗的联合应用无论在一线还是后线治疗中均可产生较强的协同作用。但研究也同时发现了有趣的现象,即相对低剂量的抗血管生成治疗用药联合免疫治疗较相对
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肺癌居恶性肿瘤致死的首位,诸多肺癌患者在诊断时已处于病情晚期。对于晚期肺癌患者,药物治疗是其主要治疗方法。在众多药物治疗策略中,抗血管生成治疗和免疫调控点治疗（免疫治疗）因其高效、低毒的特点,近年来逐步被广泛应用于肺癌治疗。临床研究发现,抗血管生成治疗和免疫治疗的联合应用无论在一线还是后线治疗中均可产生较强的协同作用。但研究也同时发现了有趣的现象,即相对低剂量的抗血管生成治疗用药联合免疫治疗较相对高剂量的抗血管生成治疗联合免疫治疗可产生更强的抗肿瘤作用效果,但其中的具体机制不明。耗竭性CD8+T细胞是抗PD-1治疗响应的主要细胞类型。CD8+T细胞耗竭是指在许多慢性感染和癌症期间出现的T细胞功能障碍状态。它由不良的效应子功能,抑制性受体（PD1、TIM3、TIGIT及LAG3等）的持续表达和不同于记忆性T细胞的转录状态而定义。CD8+T细胞耗竭通常与持续感染和肿瘤的无效控制有关,但耗竭的CD8+T细胞的活力恢复可以增强免疫力。Layilin（LAYN）在CD8+T细胞中与免疫抑制性受体（PD1、LAG3、TIGIT、TIM3等）呈现正相关,在耗竭性CD8+T细胞及Treg中表达。Layilin是1998年首次报道的一种蛋白质,编码基因位于11号染色体上。Layilin是一种与C型凝集素同源的55 kDa跨膜蛋白,在许多细胞类型和器官中都有表达。Layilin是透明质酸（HA）的其中一个表面受体。在CD8+T细胞中过表达LAYN,促使细胞因子分泌下调,杀伤肿瘤细胞能力明显下降。然而,LAYN+CD8+T细胞在肿瘤的发生发展过程中,肿瘤免疫的潜在功能和机制仍不清楚。我们的前期初步探索性研究发现,LAYN（Layilin）可能是介导抗血管生成治疗联合免疫治疗协同抗肿瘤作用的关键因子。为深入探索低剂量抗血管生成药物联合免疫治疗产生更强抗肿瘤作用效果的内在机制,本课题开展了以下研究:实验方法:1、收集肺腺癌患者肿瘤组织与癌旁组织,进行流式分析,检测LAYN在肿瘤浸润性CD8+T细胞上的表达;通过免疫组化及免疫荧光,检测LAYN在CD8+T细胞上的表达及定位情况。2、在体外进行CD8+T细胞培养,同时给予VEGFA刺激。通过qPCR检测,分析LAYN,NR4A1及TOX等的表达;通过流式细胞术,分析CD8+T细胞上免疫抑制性受体的表达。3、分离OTI小鼠的淋巴结,富集OTICD8+T细胞。通过慢病毒感染OTICD8+T细胞过表达LAYN,然后与LA795-OVA细胞株共培养,分析LAYN在CD8+T细胞肿瘤杀伤中的作用;通过Luciferase实验及Chip-qPCR,分析调控LAYN的上游转录因子。4、通过肺腺癌荷瘤小鼠造模,分别进行高低剂量抗VEGFR2联合抗PD-1治疗,观察肿瘤的生长以及小鼠的生存期,同时检测肿瘤浸润性CD8+T细胞亚群的比例,以及LAYN在PD1+CD8+T细胞上的表达。实验结果:1、与癌旁组织相比,肺腺癌患者肿瘤组织中TIM3+PD1+CD8+T细胞上LAYN高表达,主要定位于CD8+T细胞膜,伴随IFN-gama及TNF-α等细胞因子分泌下调。2、VEGFA上调CD8+T细胞中NR4A1、LAYN以及耗竭相关转录因子TOX,同时免疫抑制性受体TIGIT的表达也明显升高。VEGFA诱导TIM3+PD1+CD8+T细胞比例明显上升。3、OTICD8+T细胞过表达LAYN与肿瘤细胞LA795-OVA共培养,与对照组相比,杀伤的肿瘤细胞LA795-OVA比例明显下降。4、LAYN表达上调的机制为转录因子NR4A1直接结合LAYN启动子区域。5、与高剂量相比,低剂量抗VEGFR2治疗能下调PD1+CD8+T细胞LAYN从而促进抗肿瘤免疫治疗的疗效。结论:肺腺癌患者肿瘤组织浸润性CD8+T细胞上LAYN高表达。VEGFA能够上调LAYN及NR4A1在CD8+T细胞上的表达。LAYN具有抑制CD8+T细胞的杀伤功能,并受到转录因子NR4A1的正向调控。与高剂量抗VEGFR2联合抗PD1治疗相比,低剂量抗VEGFR2联合抗PD1治疗可显著延缓肿瘤生长,延长生存期,同时下调肺腺癌肿瘤浸润性CD8+T细胞中LAYN以及免疫抑制性受体的表达。总结,与高剂量抗VEGFR2联合抗PD1治疗相比,低剂量抗VEGFR2联合抗PD1治疗能够促进抗肿瘤免疫,其机制与肿瘤浸润性CD8+T细胞上LAYN下调有关。LAYN可能作为肿瘤免疫治疗的潜在靶点。
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