【摘 要】
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目的:建立失重性肌萎缩的动物模型,利用深度测序技术筛选出骨骼肌中与肌萎缩相关的差异表达lncRNA;分析lncRNA H19在肌萎缩模型中的表达变化,探讨H19对肌萎缩的调控作用,并阐明其作用机理。研究方法:研究一以C57BL/6小鼠和C2C12细胞为研究对象,建立肌萎缩的动物和细胞模型,应用real-time PCR、Western Blot和免疫荧光方法对模型进行验证;利用深度测序筛选出尾悬吊
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目的:建立失重性肌萎缩的动物模型,利用深度测序技术筛选出骨骼肌中与肌萎缩相关的差异表达lncRNA;分析lncRNA H19在肌萎缩模型中的表达变化,探讨H19对肌萎缩的调控作用,并阐明其作用机理。研究方法:研究一以C57BL/6小鼠和C2C12细胞为研究对象,建立肌萎缩的动物和细胞模型,应用real-time PCR、Western Blot和免疫荧光方法对模型进行验证;利用深度测序筛选出尾悬吊7天和地面对照组小鼠比目鱼肌中差异表达的lncRNA,并利用real-time PCR加以验证;研究二以C2C12细胞为研究对象,构建H19过表达质粒,在C2C12中过表达和沉默H19的同时上/下调mi R-675的水平,并诱导肌管饥饿,采用real-time PCR检测Atrogin-1和Mu RF1的m RNA表达,Western Blot方法检测IGF1R/Akt/FOXO3a信号通路相关蛋白的表达,免疫荧光方法观察肌管直径的变化;研究三以C57BL/6小鼠为研究对象,在腓肠肌中过表达mi R-675的水平或抑制其功能,并进行尾悬吊,7天后采用Western Blot方法检测IGF1R/Akt/FOXO3a信号通路相关蛋白的表达,免疫荧光观察肌肉横截面积和肌纤维数量;研究四则采用real-time PCR检测在萎缩肌管中let-7家族成员的表达情况,通过过表达let-7和/或H19水平观察let-7和H19的相互作用。研究结果:（1）小鼠尾悬吊7天Atrogin-1和Mu RF1的m RNA和蛋白水平均出现显著升高（P＜0.01或P＜0.05）,而肌管饥饿也能明显上调Atrogin-1的m RNA水平（P＜0.01）,且伴随肌管直径的显著减小（P＜0.01）;深度测序共筛选出165个差异表达的lncRNA,其中66个lnc RNA表达上调,99个lncRNA表达下调,lncRNA H19的表达出现极为显著下调（P＜0.01）;（2）过表达H19后Atrogin-1的m RNA水平明显上调（P＜0.05）,而H19对Atrogin-1的正性调节作用可在干扰miR-675功能的情况下被抑制;过表达miR-675也可引起Atrogin-1和MuRF1的mRNA水平显著上调（P＜0.05或P＜0.01）;（3）过表达miR-675能显著下调IGF1R蛋白表达和Akt的磷酸化水平（P＜0.05或P＜0.01）,并显著上调FOXO3a和Atrogin-1的蛋白表达（P＜0.01或P＜0.05）,且引起肌管直径、肌纤维平均横截面积和数量明显减少（P＜0.01或P＜0.05）,然而mi R-675的抑制则引起相反的变化;（4）肌管萎缩时部分let-7家族成员的RNA水平出现显著性升高（P＜0.05或P＜0.01）,且H19过表达则明显抑制其RNA水平的升高（P＜0.05或P＜0.01）,而let-7过表达后Atrogin-1、Mu RF1和H19的RNA水平并未出现明显变化（P＞0.05）。结论:（1）小鼠尾悬吊和肌管饥饿均能成功建立肌萎缩模型;（2）在尾悬吊诱导的肌萎缩中,lncRNA H19及其编码的miR-675的水平显著下调,其下调可能是机体的一种保护机制,在一定程度上缓解肌萎缩程度;（3）肌管萎缩时过表达H19会加剧肌萎缩程度,该作用可能通过miR-675介导;miR-675可能通过靶向IGF1R,负调控下游IGF1R/Akt/FOXO3a信号通路,从而加重肌萎缩;（4）在肌管萎缩模型中let-7未能对lncRNA H19发挥负性调节作用,lncRNA H19表达显著下调的机制还有待进一步研究阐明。
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