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硒(Selenium,Se)是一种重要的必需微量营养元素,在机体发育和免疫应答等多种生理过程中发挥着重要作用。机体摄入的硒主要以硒蛋白形式在机体中发挥作用,其中硒蛋白S(Selenoprotein S,Sel S)广泛分布于动脉血管,具有抗氧化和抗炎等多种功能。缺硒会引起家禽血管组织出现明显的病理损伤,包括通透性增加、血管内皮细胞炎性浸润、内皮细胞坏死等。中性粒细胞外捕网(Neutrophil external traps,NETs)是一种新发现的中性粒细胞活化机制,能激活血管内皮细胞,从而成为血管炎症损伤的关键环节。前期研究发现,缺硒可导致鸡血管损伤和中性粒细胞功能降低,并伴随氧化应激和硒蛋白表达降低,但缺硒是否通过硒蛋白影响NETs形成以及NETs在缺硒性动脉炎发生中的作用机制尚不明确。因此,本研究将180只1日龄Ross 308雄性肉鸡随机分为两组,每组90只,对照组(C组)日粮硒水平为0.2 mg/kg,缺硒组(-Se组)日粮硒水平为0.03 mg/kg。饲喂42 d后,获得缺硒鸡模型,再分别从C组和-Se组中随机选取45只肉鸡,以200 mg/kg·bw的剂量腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),称为C+LPS组和-Se+LPS组。LPS处理2 h后,处死,采集各组肉鸡外周血和主动脉组织,应用苏木精&伊红(Hematoxylin&Eosin,H&E)染色、蛋白质组学检测技术、实时荧光定量PCR(real-time PCR,qRT-PCR)、免疫印迹(Western Blot,WB)、免疫荧光(Immunofluorescence,IF)、生物信息学等方法,检测了肉鸡主动脉组织的组织病理学变化、趋化因子的表达、炎性因子的表达、NETs形成相关基因的表达及共定位情况、氧化应激相关指标的表达、25种硒蛋白的表达变化,确定缺硒对肉鸡主动脉的损伤情况。分离肉鸡外周血中性粒细胞,通过扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)、Sytox Green染色、DCFH-DA染色等方法,检测缺硒对中性粒细胞中乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)释放、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生和NETs形成的影响。建立中性粒细胞与PAECs共培养体系,分别开展si Sel S-PAECs、si Sel S-PAECs诱导的NETs形成以及NET-DNA诱导的PAECs炎症反应试验,以期阐明NETs与鸡缺硒性动脉炎的相关性、Sel S调控NETs形成的机制及NETs在鸡缺硒性动脉炎发生中的作用机制。研究结果如下:(1)-Se组肉鸡血浆中硒含量显著降低;组织病理学观察发现-Se组肉鸡的主动脉组织内可见淋巴细胞、浆细胞和单核细胞浸润,内膜和外膜胶原纤维增生,中膜弹性纤维部分断裂,内膜轻度隆起。C+LPS组肉鸡的主动脉内可见主动脉弹性板破坏和中断,交替的瘢痕组织,内膜表面凹凸不平,大量斑块隆起,外膜大量胶原纤维增生,血管壁增厚和炎性细胞浸润。-Se+LPS组肉鸡的主动脉内可见平滑肌细胞变性坏死,弹性纤维破坏,炎性细胞浸润,内外弹性膜破裂,肉芽肿性炎症反应,包括多核巨细胞、上皮样细胞、淋巴细胞和单核细胞浸润;应用qRT-PCR、WB和IF等实验技术发现-Se组肉鸡的主动脉内炎性因子肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、干扰素α(Interferon-α,IFN-α)、白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-17和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)的表达水平显著升高,说明缺硒可导致肉鸡动脉发生炎症损伤。(2)通过蛋白质组学分析发现,-Se组肉鸡主动脉组织中的179个蛋白表达上调,173个蛋白表达下调。对差异表达蛋白(Differentially expressed proteins,DEPs)进行GO和KEGG富集分析发现,DEPs主要参与氧化还原途径、能量代谢途径、心肌收缩途径及过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)途径。应用qRT-PCR对炎症反应、氧化应激和PPAR途径相关DEPs进行了筛选及验证,初步证实了测序的准确性。(3)应用qRT-PCR、WB和IF等实验技术分析发现,-Se组肉鸡的主动脉组织中的中性粒细胞趋化因子C-C主题趋化因子1(C-C motif chemokine 1,CCL1)、CCL4、CCL17、趋化因子配体12(C-X-C motif chemokine 12,CXCL12)、CXCL13和CXCL14)、NETs形成的相关蛋白髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)、NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2,NOX2)、蛋白激酶Cα(Protein kinase Cα,PKCα)、PKCβ、PKCζ和磷酸肌醇特异性磷脂酶Cγ(Phosphoinositide-specific phospholipase Cγ,PLCγ)的表达水平升高,且这些指标在-Se+LPS组中的升高更显著。应用SEM和Sytox Green染色发现-Se组肉鸡外周血中性粒细胞NETs形成增加,说明缺硒可募集发炎的主动脉周围的中性粒细胞,促进了肉鸡主动脉及外周血中性粒细胞释放NETs。(4)应用qRT-PCR方法对肉鸡主动脉组织中的25种硒蛋白进行m RNA表达水平的检测,发现与对照组相比,-Se组和-Se+LPS组中硒蛋白的表达均降低,其中Sel S的m RNA表达水平下降最显著,其余受缺硒影响较为明显的硒蛋白分别为碘甲状腺原氨酸脱碘酶1(Iodothyronine deiodinase 1,DIO1)、DIO1、DIO2、DIO3、Sel K、谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase4,GPX4)、Sel M、Sel P2、Sel I和GPX1,说明缺硒降低了肉鸡动脉组织硒蛋白的表达,并提示Sel S可能在鸡缺硒性动脉炎性损伤中发挥重要作用。在体外通过细胞转染技术沉默鸡动脉内皮细胞(Chicken artery endothelial cells,PAECs)中的Sel S后,经IF检测发现TNF-α和IL-1β的表达显著升高,说明Sel S对动脉炎具有重要调节作用。进一步将si Sel S-PAECs与鸡外周血中性粒细胞共培养,发现NETs形成显著增加,说明Sel S表达降低可引起动脉内皮释放细胞炎性因子,并促进NETs形成。(5)应用qRT-PCR方法检测肉鸡主动脉组织中抗氧化基因过氧化氢酶(Catalase,CAT)、血红素氧合酶1(Heme oxygenase 1,HO-1)、超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase 1,SOD1)和SOD2的m RNA表达水平发现,与对照组相比,上述抗氧化基因的m RNA表达水平在-Se组的主动脉组织中显著降低;通过荧光染色发现-Se组和C+LPS组中的鸡外周血中性粒细胞的ROS水平显著升高,表明缺硒能够引起肉鸡主动脉和外周血中性粒细胞发生氧化应激。在体外用佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)刺激鸡外周血中性粒细胞产生NETs后,与PAECs进行共培养,发现PAECs中TNF-α和IL-1β的表达显著升高,说明了NET-DNA可诱导PAECs发生炎症反应。在si Sel S-PAECs、si Sel S-PAECs诱导的NETs形成以及NET-DNA诱导的PAECs炎症反应中,均检测到ROS的爆发,但在ROS抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetylcysteamine acid,NAC)预处理的si Sel S-PAECs中,与NAC预处理的NC-PAECs相比,NETs几乎均未形成,结合体内试验结果,说明Sel S表达降低可诱导ROS依赖性NETs形成,引起PAECs的炎症反应。(6)蛋白质组学KEGG富集分析,发现PPAR途径在-Se组肉鸡主动脉中的显著富集,应用qRT-PCR方法检测肉鸡主动脉组织中PPAR途径的激活情况,发现-Se组肉鸡主动脉中PPARα、PPARβ和PPARγ的表达水平显著下调,说明缺硒可抑制肉鸡主动脉中的PPAR途径。进一步在si Sel S-PAECs、si Sel S-PAECs诱导的NETs形成以及NET-DNA诱导的PAECs炎症反应试验中,应用qRT-PCR和WB对PPAR途径相关蛋白的表达水平进行检测发现,与相应的对照组相比,各实验组共培养液中的PPARα、PPARβ和PPARγ的m RNA和蛋白表达水平均显著下降,说明在Sel S表达降低对PPAR途径具有抑制作用。此外,经PPAR激动剂苯扎贝特(Bezafibrate,BZF)预处理的si Sel S-PAECs失去了诱导NETs形成的能力,并且缓解了PAECs的炎症程度,结合体内试验结果,说明PPAR途径的激活可逆转Sel S表达降低诱导的NETs形成,进而缓解动脉炎。综上所述,缺硒导致肉鸡主动脉组织Sel S表达降低,发生氧化应激,使中性粒细胞趋化因子释放增加,中性粒细胞向主动脉组织募集,通过促使NETs释放增加,进而诱导缺硒性动脉炎的发生。本研究首次从Sel S角度探讨其对NETs形成的调控作用,进一步揭示了鸡缺硒性动脉炎的发生机制,为缺硒诱导的鸡动脉损伤机制提供了重要理论基础和试验数据,并极大地丰富了Sel S的生物学内容。