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石斑鱼是我国和东南亚地区重要的海水养殖鱼类，具有极高的经济价值。然而近年来，由于养殖密度的提高和海水养殖环境的恶化，石斑鱼病害频发，给石斑鱼养殖业造成了严重的经济损失。其中，新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singaporegrouper iridovirus，SGIV)是一种高致病性病原，可导致石斑鱼死亡率高达90％以上。目前，关于SGIV感染过程中免疫逃避机制的研究还鲜有报导。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是一类具有生物多效性的促炎症细胞因子，与细胞表面受体TNFR1结合，可引起炎症反应、细胞凋亡、细胞毒性等，在抗肿瘤和抗病原体入侵中发挥重要的作用;与TNFR2结合，则可引起细胞增殖、细胞分化、免疫活化等效应。大量的研究表明，痘病毒、疱疹病毒等大DNA病毒可通过自身编码的TNFR同源类似物(vTNFR)来干扰宿主的TNF信号通路，从而逃避宿主的免疫应答。SGIV是大分子DNA病毒，包含162个基因开放阅读框(open reading frame，ORF)，生物信息学分析显示，ORF050编码的是一个肿瘤坏死因子受体类似物基因，可能在SGIV的免疫逃避中发挥一定的作用。因此，本论文对SGIV ORF050进行了基因克隆、特征分析和功能分析，取得了以下研究成果:
1、通过PCR扩增，从SGIV基因组中克隆出ORF050基因。生物信息学分析结果表明，SGIV ORF050含有4个保守的TNFR功能结构域—半胱氨酸富集结构域(cysteine-rich domain，CRD)，在N端有信号肽，在C端有跨膜区。通过氨基酸序列比对，发现SGIV ORF050编码的蛋白和其他鱼类、人、小鼠及牛痘病毒编码的TNFR的同源性大于30％。构建了原核表达质粒pMAL-ORF050，成功在大肠杆菌中诱导表达了MBP-ORF050融合蛋白，并对其进行了纯化，用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了ORF050的多克隆抗体。
2、应用反转录PCR和药物抑制实验对ORF050基因的转录时序进行了分析，结果表明ORF050是病毒的一个立即早期基因。体外转染ORF050全长基因和四个CRD分别缺失的pEGFP-N3真核表达重组质粒，分析其亚细胞定位。结果显示ORF050编码的蛋白在细胞质内呈弥散性均匀分布，当缺失第一个CRD后，基因的定位发生明显的变化，即呈点状分布在胞质中，推测第一个CRD对其细胞内定位和功能有影响。
3、利用体外过表达技术，筛选过量表达ORF050的FHM细胞系和GS细胞系，并用病毒感染。发现过表达ORF050不能明显影响SGIV感染引起的细胞病变效应(cytopathic effect，CPE);荧光定量PCR检测结果表明过表达ORF050对SGIV主要衣壳蛋白MCP基因的转录表达水平也没有明显影响，提示ORF050对SGIV感染引起的细胞凋亡、对SGIV在FHM细胞和GS细胞中的复制增殖可能没有影响。
4、荧光定量PCR检测SGIV感染后，过表达ORF050的GS细胞中宿主TNF/TNFR的转录水平，结果显示TNF1、TNF2和TNFR2的表达量均有明显的上升，而TNFR1的表达量没有明显变化。双荧光素酶报告基因实验结果显示，ORF050不能激活NF-κB的转录活性，说明SGIV可能通过ORF050来调节细胞TNF和TNFR，从而逃避宿主的免疫攻击，但具体的作用机制还有待深入的研究。
5、利用嘌呤霉素抗性基因-EGFP双筛选标记，通过嘌呤霉素筛选、荧光显微镜观察和挑斑实验，成功构建并筛选纯化了较纯的ORF050敲除重组病毒，为应用重组病毒技术研究鱼类虹彩病毒的感染致病机制奠定了一定的基础。