前言脑缺血是严重威胁人类健康的高发的疾病之一,其损伤机制有兴奋性毒性,钙超载,细胞凋亡,炎症,自由基,一氧化氮以及线粒体的损伤。血脑屏障结构破坏和功能的变化是脑缺血早期的重要病理过程之一,并且是脑缺血早期死亡的主要危险因素之一。因此,研究脑缺血时血脑屏障通透性的变化以及可能的保护机制对脑缺血的治疗具有重要的意义。绿茶多酚(green tea polyphenols, GTPs)是绿茶中所含的一类多羟基酚类化合物的总称,其主要成分是儿茶素类化合物,其中表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)的含量最高,约占儿茶素的80%,被认为是绿茶多酚生物活性的主要来源。近年来研究发现,绿茶多酚具有多方面的药理作用,如抗氧化、抗焦虑、抗肿瘤、抗辐射损伤、抗炎、降低血糖和血脂作用等,其神经保护作用机制与金属螯合,自由基清除,影响细胞存活和凋亡基因的过度表达以及对信号转导通路,线粒体功能和泛素-蛋白酶体系统的调节有关,通过这些机制,绿茶多酚对帕金森病和阿尔茨海默氏症等神经变性疾病具有防治作用。但绿茶多酚对脑缺血时血脑屏障通透性的影响尚未见报道。脑微血管内皮细胞是血脑屏障的重要组成部分,内皮细胞质膜表面含有丰富的内陷囊状结构,即胞膜窖(caveolae)。物质通过血脑屏障一般有两种途径：细胞旁途径和跨细胞途径。Caveolae介导的内化途径是经典的跨细胞途径之一,caveolin-1是caveolae的标志性蛋白,内皮细胞有可能是通过ERK1/2和p38MAPK途径下调caveolin-1的表达。本研究通过给大鼠灌胃服用绿茶多酚,旨在探讨绿茶多酚对脑缺血大鼠血脑屏障通透性的影响和可能的相关机制。材料和方法一、实验材料(一)实验动物本研究采用中国医科大学实验动物中心提供的Wistar大鼠,雄性,体重250～300g。(二)主要试剂绿茶多酚(杭州禾田生物有限公司)；兔抗大鼠caveolin-1,p-ERKl/2和ERK1／2抗体(美国Santa Cruz公司)；小鼠抗大鼠β-actin抗体(武汉博士德试剂公司)；β-actin,辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二次抗体(北京中山公司)；辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(武汉博士德试剂公司)；SP免疫组化试剂盒、DAB显色剂(福州迈新生物技术有限公司)；RT-PCR试剂盒(Takara公司)；伊文思蓝(日本Fluka公司)。(三)主要仪器大鼠脑立体定位仪(日本光电株式会社)；激光多普勒脑血流仪(moorLAB, England); PCR仪(德国Biometra公司)；电子分析天平；恒温水浴箱；低温冷冻离心机(Hitachi, Japan);通用电泳仪(Bio-Rad, USA);转印仪(北京市六一仪器厂)；-80℃深度冰箱(Toshiba, Japan);恒温冷冻切片机(Leica, GER)。二、实验方法(一)动物准备及分组：实验大鼠随机分成两组：对照组和绿茶多酚组,根据缺血时间不同,将每组大鼠进一步分为：缺血0h组,缺血1h组,缺血2h组及缺血4h组。绿茶多酚组大鼠按400mg/kg灌服绿茶多酚蒸馏水溶液,每日2次,每次1mL；对照组给予等体积蒸馏水,自由饮食,活动。灌胃30天后,进行局灶性脑缺血模型的制作。(二)大鼠脑缺血模型的制备。(三)大鼠神经行为学评分和脑梗死体积的测定。(四)应用伊文思蓝渗透性评估血脑屏障通透性的变化。(五)RT-PCR法检测缺血脑组织微血管段caveolin-1的mRNA表达。(六)免疫组化法检测缺血脑组织微血管内皮细胞caveolin-1的分布和表达变化。(七)Wesrern blot法检测缺血脑组织微血管段caveolin-1, p-ERK1/2蛋白表达的变化。(八)图象分析免疫组化结果用Motic Images Advanced 3.2实时图象分析系统采集照片并进行定量分析。Western blot结果用Chemi Imager 5500V 2.03软件扫描,用Fluor Chen2.0软件定量分析显色带的IDV值。(九)统计学处理所有数值均以均数±标准差表示,实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。实验结果一、应用激光多普勒血流仪监测大脑中动脉供血区脑组织的血流变化各组大鼠于MCAO前记录局部大脑中动脉供血区脑血流值,作为基础值。行MCAO后,再次检测该区脑血流,其血流值下降到基础值的30%以下即可认为MCAO缺血模型成功。血流值未下降到30%以下和手术导致皮层出血的大鼠舍弃。二、绿茶多酚对神经功能、梗死体积和血脑屏障通透性的影响在缺血0h,1h和2h组未发现梗死区。与对照组缺血4h相比,绿茶多酚显著降低了梗死体积(P<0.01)；与对照组缺血2h和4h组相比,绿茶多酚也显著改善了大鼠的神经功能缺损(P<0.05,P<0.01)。应用伊文思蓝渗透性评估血脑屏障通透性的变化,发现对照组和绿茶多酚组大鼠在缺血0h脑组织未见蓝染,随着缺血时间延长,缺血部位脑组织蓝染有不同程度加重；而绿茶多酚组大鼠在缺血1h,2h和4h的缺血蓝染程度较对照组明显减轻。在对照组内,与缺血0h组相比,缺血1h,2h和4h组脑组织EB含量均显著高于0h组(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。绿茶多酚缺血0h组的脑组织EB含量与对照组0h组相比没有统计学差异,而绿茶多酚缺血1h,4h组的EB含量与对照组缺血1h,4h组相比下降有统计学差异(P<0.05,P<0.05),绿茶多酚缺血2h组的EB含量与对照缺血2h组相比则显著下降(P<0.01)。三、绿茶多酚对缺血区脑组织微血管段caveol in-1的mRNA表达的影响在对照组中,与缺血0h组相比,缺血1h,2h和4h组caveolin-1的mRNA表达显著增加(P<0.01,P<0.01,P<0.01),缺血4h组与其它对照组相比,均有显著差异(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。绿茶多酚缺血0h组与对照缺血0h组相比,caveolin-1的mRNA表达水平没有明显差异(P>0.05),绿茶多酚缺血1h、2h、4h组与对照缺血同时点组相比,caveolin-1的mRNA表达均显著下降(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。四、绿茶多酚对缺血区脑组织微血管段内皮细胞caveolin-1蛋白表达的影响Caveolin-1蛋白在各组大鼠脑组织中均沿血管呈阳性表达；免疫组化结果显示缺血组随着缺血时间延长caveolin-1的表达量增加,与对照缺血0h组相比,缺血1h,2h和4h组caveolin-1的表达水平显著增加(P<0.01,P<0.01,P<0.01)；绿茶多酚缺血0h组与对照缺血0h相比,caveolin-1的表达水平没有显著差异(P>0.05),但缺血1h,2h和4h组与对照缺血1h,2h和4h组相比则显著下降(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。五、绿茶多酚对缺血区脑组织微血管段caveolin-1蛋白表达水平的影响Western blot结果显示caveolin-1蛋白的表达变化趋势与免疫组化结果一致,即缺血组随着缺血时间延长,caveolin-1蛋白表达量增加,在对照组内：与缺血0h相比,缺血1h,2h,4h组的caveolin-1的蛋白表达水平均显著增加(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。绿茶多酚缺血0h组与对照缺血0h相比,caveolin-1的表达水平没有显著差异(P>0.05),但缺血1h,2h和4h组与对照缺血1h,2h和4h组相比显著下降(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。六、绿茶多酚对缺血区脑组织微血管段p-ERK1/2蛋白表达水平的影响Western blot结果显示p-ERK1/2蛋白的表达变化趋势与caveolin-1表达结果一致,在缺血组中随着缺血时间延长,p-ERK1/2蛋白表达量增加。在对照组中,与缺血0h相比,缺血1h,2h,4h组的ERK1/2的蛋白表达水平均显著增加(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。绿茶多酚缺血Oh组与对照组缺血0h相比,p-ERK1/2的表达水平没有显著差异(P>0.05),缺血1h,2h和4h组与对照组缺血1h,2h和4h相比均显著下降(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。讨论在本研究中,预先对大鼠进行灌胃服用绿茶多酚溶液,然后建立局灶性脑缺血模型,观察绿茶多酚对大鼠脑缺血后血脑屏障通透性变化的影响。发现与对照组缺血0h相比,缺血1h,2h和4h组缺血区脑组织EB含量显著增加；绿茶多酚的缺血1h,2h,4h组的EB含量与对照组缺血同时点组相比显著下降,绿茶多酚显著下调缺血脑组织微血管段的caveolin-1 mRNA,蛋白水平和p-ERK1/2蛋白表达。本研究结果提示,绿茶多酚对脑缺血时血脑屏障的通透性具有保护作用,其机制可能与血管内皮细胞的caveolin-1 mRNA和蛋白的表达下调相关,p-ERK1/2表达下调可能与caveolin-1的变化相关。脑缺血导致血脑屏障开放,已有研究证明绿茶多酚能预防中风,可以作为脑缺血后的神经保护因子。目前关于绿茶多酚的研究主要是对神经元的保护作用。绿茶多酚口服吸收后分布广泛,也可通过血脑屏障进入脑组织,减少脑缺血导致的梗死体积和神经元损伤。在动物实验中,EGCG具有显著的抗氧化功能,可以预防局部脑缺血造成的神经损伤和梗塞,脑缺血再灌注后脑梗死体积明显降低,依然能显示抗氧化和预防神经损伤的功能。在本研究中与对照组相比,绿茶多酚组显著降低了缺血组增高的血脑屏障通透性,首次证实绿茶多酚对缺血时血脑屏障的通透性具有保护作用。Caveolin是caveolae的主要结构成分,在内皮细胞的功能有：跨细胞转运作用,入胞作用,调节内皮组织通透性,致动脉粥样硬化,并参与G-蛋白介导的信号转导,酪氨酸激酶的级联反应,蛋白激酶C和eNOS的信号通路等,在血脑屏障中具有重要作用,但其作用机制还不清楚。细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)包括ERKl和ERK2,统称为ERK1／2,磷酸化激活后,可将信号从表面受体传至核内,作用于多种转录因子,在神经系统中ERK1／2调节神经元分化,可塑性及神经元存活,介导了胞外因子的神经保护作用。在本研究中,脑缺血后微血管内皮细胞ERK1／2磷酸化水平表达增加,而绿茶多酚则使ERK1／2活性显著降低。我们推测绿茶多酚有可能通过调节NOS活性,进而改变内皮细胞caveolin-1的表达水平,ERK1／2可能是其发挥作用的重要物质之一。结论1、绿茶多酚组显著降低了脑缺血时增高的血脑屏障通透性。2、绿茶多酚显著降低了脑缺血时增加的脑微血管内皮细胞caveolin-1的mRNA和蛋白表达,这可能是绿茶多酚对缺血时血脑屏障通透性起到保护作用的机制之一。3、绿茶多酚显著降低了脑缺血时增加的脑微血管内皮细胞p-ERK1/2蛋白表达。