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研究背景：
脱落乳牙牙髓干细胞SHED(stem cells from human exfoliated deciduous teeth)源于自然更替的乳牙，易得无创，具有间充质干细胞的优良特性，是组织工程技术中理想的种子细胞。且SHED为神经嵴来源，能分泌多种神经营养因子、细胞因子，可表达许多神经元及胶质细胞标记物[1]。以往的实验研究证明SHED对多种神经系统疾病有明确的治疗作用,包括外伤性脑损伤、周围神经损伤、神经退变性疾病如帕金森病等，也有部分报道其用于脊髓损伤治疗的[2]。
脊髓损伤是一类具有高发病率、高致残率，给患者、家庭和社会带来极大危害的疾病，然而现有治疗方法效果不佳,急需开发新的有效疗法。目前前沿的临床试验中，细胞移植尤其是骨髓间充质干细胞(BMMSCs)治疗脊髓损伤的研究较为常见,但培养BMMSCs需抽取大量骨髓,这就存在一定的风险,包括感染和疼痛等,且受限于患者的年龄和健康状况。研究人员需继续探究更合适的细胞来源，已有一些关于SHED、UCMSCs(脐带间充质干细胞)用于脊髓损伤探究的，它们易得无创且有较好疗效[3,4]。但报道中的治疗方式主要为损伤局部单细胞悬液注射或细胞复合含支架的组织工程材料移植。细胞聚合体基于发育原理，相对于单细胞悬液和含支架的组织工程材料有一定优势；且已有较多关于细胞聚合体技术应用于心肌梗死、角膜损伤、皮肤损伤、骨软骨、牙周及牙髓组织再生治疗等研究[5-8]，但目前鲜有细胞聚合体技术应用于脊髓损伤治疗的报道。SHED有很强的神经再生功能，而脊髓损伤的治疗正缺乏这种极具来源优势的干细胞，且细胞聚合体技术恰好应该能为脊髓损伤区域的修复提供桥接。因此，我们猜测SHED聚合体也能治疗大鼠脊髓损伤。
研究目的：
探究SHED的新应用：首次探究SHED聚合体治疗大鼠脊髓损伤的可行性，并进行疗效优化，为脊髓损伤治疗提供新思路。
研究方法：
1.SHED、UCMSCs的分离培养与鉴定：对SHED、UCMSCs进行原代培养、差异贴壁法分离纯化，流式细胞术进行表面标志物鉴定，CCK-8检测对比二者增殖能力，并进行成骨、成脂等多项分化能力检测。
2.SHED聚合体、UCMSCs聚合体的制备及生物学性能比较：用特殊的培养基诱导SHED聚合体、UCMSCs聚合体形成；对二者进行切片、HE染色观察组织结构；并分别从基因水平及蛋白水平，对SHED和UCMSCs的细胞状态和聚合体状态是相关神经营养因子的表达做RT-PCR及ELISA检测。
3.SHED聚合体、UCMSCs聚合体治疗大鼠脊髓损伤的疗效比较：体内实验，建立大鼠脊髓全横断损伤模型，分别将SHED聚合体(SHED CA)、UCMSCs聚合体(UC CA)移植入脊髓损伤区进行治疗，观察8周，分别从行为学功能恢复、神经电生理恢复及神经源性标记物的免疫荧光染色等方面比较二者疗效。
4.联合治疗法优化SHED聚合体的疗效：之前实验发现SHED聚合体疗效优于UCMSCs聚合体，现拟采用联合治疗的方法探究基于SHED聚合体的具有更优疗效的疗法，并与类似文献中具有很好疗效的疗法作对比。分别设置单纯SHED聚合体治疗组(SHED-CA )、SHED聚合体联合SHED悬液注射治疗组(SHED-CA+SHED)及SHED复合fibringlue支架再联合SHED悬液注射治疗组(SHED-FG+SHED文献中方法)，观察12周，仍从行为学恢复、神经电生理及免疫荧光染色等方面进行疗效比较。
研究结果：
1.分离培养的SHED、UCMSCs呈长梭形或成纤维细胞样；流式鉴定：间充质干细胞表面标志物呈阳性，造血及内皮细胞表面标志物阴性；具有很强的自我更新能力及成骨成脂等多向分化能力；表明培养的细胞确实具有间充质干细胞的特性。
2.同样条件培养的SHED聚合体比UCMSCs聚合体厚、富含更多细胞和细胞外基质；大多神经营养因子的表达都是聚合体状态要比细胞状态高表达，且SHED聚合体比UCMSCs聚合体高表达。
3.SHEDCA、UCCA体内疗效对比结果显示：行为学评定及神经电生理结果均显示SHEDCA治疗大鼠脊髓全横断损伤疗效要优于UCCA；免疫荧光染色结果提示SHEDCA，UCCA可能通过旁分泌等机制促进内源性修复而非直接的分化发挥作用。
4.联合疗法进行疗效优化实验结果显示：行为学评分及神经电生理结果均显示SHED-CA+SHED疗效最好，SHED-FG+SHED次之，SHED-CA最差；免疫荧光染色结果提示：联合SHED悬液注射可提高SHED聚合体的疗效，可能通过改善局部微环境，更有利于移植物存活及发挥作用；联合SHED悬液注射时，SHED-CA要比联合fibringlue的外源性支架材料效果好。
结论：
SHED聚合体、UCMSCs聚合体均可用于治疗大鼠脊髓损伤，且SHED聚合体疗效优于UCMSCs聚合体；SHED聚合体的疗效优于SHED复合外源性支架fibringlue的疗效，且联合SHED悬液注射治疗能提高SHED聚合体疗效；SHED可能通过旁分泌机制分泌神经营养因子等，创造有利于脊髓损伤修复的微环境以及直接分化为髓鞘细胞而发挥作用。
脱落乳牙牙髓干细胞SHED(stem cells from human exfoliated deciduous teeth)源于自然更替的乳牙，易得无创，具有间充质干细胞的优良特性，是组织工程技术中理想的种子细胞。且SHED为神经嵴来源，能分泌多种神经营养因子、细胞因子，可表达许多神经元及胶质细胞标记物[1]。以往的实验研究证明SHED对多种神经系统疾病有明确的治疗作用,包括外伤性脑损伤、周围神经损伤、神经退变性疾病如帕金森病等，也有部分报道其用于脊髓损伤治疗的[2]。
脊髓损伤是一类具有高发病率、高致残率，给患者、家庭和社会带来极大危害的疾病，然而现有治疗方法效果不佳,急需开发新的有效疗法。目前前沿的临床试验中，细胞移植尤其是骨髓间充质干细胞(BMMSCs)治疗脊髓损伤的研究较为常见,但培养BMMSCs需抽取大量骨髓,这就存在一定的风险,包括感染和疼痛等,且受限于患者的年龄和健康状况。研究人员需继续探究更合适的细胞来源，已有一些关于SHED、UCMSCs(脐带间充质干细胞)用于脊髓损伤探究的，它们易得无创且有较好疗效[3,4]。但报道中的治疗方式主要为损伤局部单细胞悬液注射或细胞复合含支架的组织工程材料移植。细胞聚合体基于发育原理，相对于单细胞悬液和含支架的组织工程材料有一定优势；且已有较多关于细胞聚合体技术应用于心肌梗死、角膜损伤、皮肤损伤、骨软骨、牙周及牙髓组织再生治疗等研究[5-8]，但目前鲜有细胞聚合体技术应用于脊髓损伤治疗的报道。SHED有很强的神经再生功能，而脊髓损伤的治疗正缺乏这种极具来源优势的干细胞，且细胞聚合体技术恰好应该能为脊髓损伤区域的修复提供桥接。因此，我们猜测SHED聚合体也能治疗大鼠脊髓损伤。
研究目的：
探究SHED的新应用：首次探究SHED聚合体治疗大鼠脊髓损伤的可行性，并进行疗效优化，为脊髓损伤治疗提供新思路。
研究方法：
1.SHED、UCMSCs的分离培养与鉴定：对SHED、UCMSCs进行原代培养、差异贴壁法分离纯化，流式细胞术进行表面标志物鉴定，CCK-8检测对比二者增殖能力，并进行成骨、成脂等多项分化能力检测。
2.SHED聚合体、UCMSCs聚合体的制备及生物学性能比较：用特殊的培养基诱导SHED聚合体、UCMSCs聚合体形成；对二者进行切片、HE染色观察组织结构；并分别从基因水平及蛋白水平，对SHED和UCMSCs的细胞状态和聚合体状态是相关神经营养因子的表达做RT-PCR及ELISA检测。
3.SHED聚合体、UCMSCs聚合体治疗大鼠脊髓损伤的疗效比较：体内实验，建立大鼠脊髓全横断损伤模型，分别将SHED聚合体(SHED CA)、UCMSCs聚合体(UC CA)移植入脊髓损伤区进行治疗，观察8周，分别从行为学功能恢复、神经电生理恢复及神经源性标记物的免疫荧光染色等方面比较二者疗效。
4.联合治疗法优化SHED聚合体的疗效：之前实验发现SHED聚合体疗效优于UCMSCs聚合体，现拟采用联合治疗的方法探究基于SHED聚合体的具有更优疗效的疗法，并与类似文献中具有很好疗效的疗法作对比。分别设置单纯SHED聚合体治疗组(SHED-CA )、SHED聚合体联合SHED悬液注射治疗组(SHED-CA+SHED)及SHED复合fibringlue支架再联合SHED悬液注射治疗组(SHED-FG+SHED文献中方法)，观察12周，仍从行为学恢复、神经电生理及免疫荧光染色等方面进行疗效比较。
研究结果：
1.分离培养的SHED、UCMSCs呈长梭形或成纤维细胞样；流式鉴定：间充质干细胞表面标志物呈阳性，造血及内皮细胞表面标志物阴性；具有很强的自我更新能力及成骨成脂等多向分化能力；表明培养的细胞确实具有间充质干细胞的特性。
2.同样条件培养的SHED聚合体比UCMSCs聚合体厚、富含更多细胞和细胞外基质；大多神经营养因子的表达都是聚合体状态要比细胞状态高表达，且SHED聚合体比UCMSCs聚合体高表达。
3.SHEDCA、UCCA体内疗效对比结果显示：行为学评定及神经电生理结果均显示SHEDCA治疗大鼠脊髓全横断损伤疗效要优于UCCA；免疫荧光染色结果提示SHEDCA，UCCA可能通过旁分泌等机制促进内源性修复而非直接的分化发挥作用。
4.联合疗法进行疗效优化实验结果显示：行为学评分及神经电生理结果均显示SHED-CA+SHED疗效最好，SHED-FG+SHED次之，SHED-CA最差；免疫荧光染色结果提示：联合SHED悬液注射可提高SHED聚合体的疗效，可能通过改善局部微环境，更有利于移植物存活及发挥作用；联合SHED悬液注射时，SHED-CA要比联合fibringlue的外源性支架材料效果好。
结论：
SHED聚合体、UCMSCs聚合体均可用于治疗大鼠脊髓损伤，且SHED聚合体疗效优于UCMSCs聚合体；SHED聚合体的疗效优于SHED复合外源性支架fibringlue的疗效，且联合SHED悬液注射治疗能提高SHED聚合体疗效；SHED可能通过旁分泌机制分泌神经营养因子等，创造有利于脊髓损伤修复的微环境以及直接分化为髓鞘细胞而发挥作用。