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凝血酶与凝血因子Xa直接参与凝血过程,是凝血级联反应的关键酶,其抑制剂的研发是治疗血栓栓塞性疾病的重要策略之一。课题组前期研究表明茶叶中部分儿茶素类成分具有抑制凝血酶的活性,同时发现丹参和川芎中也具有凝血酶和凝血因子Xa的抑制活性成分。本论文研究旨在建立多元统计分析结合LC-MS分析的方法表征茶叶中的凝血酶抑制剂以及谱-效关系分析方法筛选丹参-川芎药对中的凝血酶和凝血因子Xa抑制剂,并通过分子对接分析预测酶与活性成分间的相互作用。论文主要包括五个章节的内容,其中三个章节为实验研究。第一章为文献综述。首先介绍了凝血酶及其天然抑制剂的研究进展,其次分别概述了茶叶及丹参-川芎药对的主要化学成分和药理作用,然后介绍了多元统计分析和谱-效关系分析在天然活性成分筛选中的应用,最后提出本论文的研究目的、意义与研究内容。第二章研究的内容为LC-MS结合多元统计分析表征茶叶中凝血酶抑制剂。首先测定十个茶叶（毛峰、碧螺春、云南红茶、武夷红茶、大红袍、铁观音、生普洱、熟普洱、白茶、黑茶）提取物对凝血酶的抑制活性,同时对十个茶叶进行LC-MS分析。采用主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）和正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA）处理基于活性测试结果分组后的LC-MS数据。结果筛选出十二个差异标记物,其中六个经MS鉴定为表没食子儿茶素3-O-没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素（EGC）、没食子儿茶素3-O-没食子酸酯（GCG）、山奈酚-3-O-葡萄糖基-鼠李糖基-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-半乳糖基-鼠李糖基葡萄糖苷。体外活性验证结果显示EGCG、ECG、EGC和GCG对凝血酶的IC50值分别为5.033、6.573、6.704和6.842 m M。最后,分子对接结果表明LEU41、ASP189、GLU192、GLY216、GLY219、SER195、GLY193和SER214等可能是EGCG、ECG、EGC和GCG与凝血酶作用的氨基酸残基。这些活性化合物的发现为茶叶中凝血酶抑制剂的研究提供了参考。第三章研究采用谱-效关系分析方法筛选丹参-川芎药对中凝血酶和凝血因子Xa的抑制活性成分。首先采用回流提取法制备不同比例（1:0、1:1、2:1、3:1、5:1、1:5、1:3、1:2、0:1）的丹参-川芎药对提取物,并测试其对凝血酶和凝血因子Xa的抑制活性。采用典型相关分析（CCA）将酶抑制实验结果与药对指纹图谱中71个峰的峰面积进行谱-效分析。结果筛选出十个潜在的活性化合物,经MS鉴定出其中八个化合物的化学结构。对六个潜在活性成分即绿原酸、Z-藁本内酯、咖啡酸、阿魏酸、丹参酮I和丹参酮IIA进行体外活性验证。结果表明,绿原酸具有良好的凝血酶抑制活性(IC50值为185.08μM),丹参酮I(IC50为112.59μM)和丹参酮IIA(IC50为138.19μM)具有良好的凝血因子Xa抑制活性。最后分子对接研究表明,绿原酸通过范德华力和离子键等多种作用与凝血酶结合。丹参酮I和丹参酮IIA通过与残基SER214、GLY219和GLN192形成氢键与凝血因子Xa结合,其结合能分别为-7.87 kcal·mol-1和-7.44 kcal·mol-1,与活性验证结果吻合。总之,本研究采用谱-效关系成功从丹参-川芎药对中筛选出凝血酶与凝血因子Xa抑制剂,为药对的药效物质基础研究提供参考。第四章研究的内容为HPLC法测定丹参-川芎药对中九个化学成分的含量。首先对测定方法的线性关系、精密度、稳定性、检测限和定量限进行方法学考察。结果表明,绿原酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、阿魏酸松柏酯、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA浓度分别在3.125-200、3.125-400、3.125-400、12.5-1600、3.125-400、3.125-400、3.125-100、3.125-100和3.125-100μg/m L的范围内与峰面积的线性关系良好（R~2=0.9992-0.9999）。精密度试验和稳定性试验结果表明方法的精密度和稳定性良好。然后,制备不同比例丹参-川芎药对（1:0、1:1、2:1、3:1、2:3、3:4、4:3、3:2、1:3、1:2、0:1）的供试品溶液,采用建立的方法对九个化学成分进行含量测定。含量测定的结果表明绿原酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、阿魏酸松柏酯、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA在不同比例丹参-川芎药对中的含量分别为0.43-0.62、1.32-1.56、1.55-2.15、7.15-11.16、0.12-0.55、1.64-2.24、0.60-0.86、0.94-1.38、0.50-0.80 mg/g,为丹参-川芎药对的质量控制提供分析方法参考。论文的第五章为结论与展望。本论文采用LC-MS结合多元统计分析筛选茶叶中抑制凝血酶的活性成分,为饮茶降低心血管疾病风险提供一定的依据。采用谱-效关系分析筛选出丹参-川芎药对中凝血酶及凝血因子Xa抑制剂,同时建立HPLC法测定丹参-川芎药对中主要化学成分的含量,为丹参-川芎药对的物质基础和质量控制研究提供参考。