论文部分内容阅读
目的采用基因芯片的方法筛选烧伤患者变性真皮较正常皮肤中差异表达的miRNAs,然后预测其靶基因以及对变性真皮可能起保护作用的信号通路；挑选出在细胞增殖和迁移中发挥重要作用的miR-199a-5p及miR-126,检测其在大鼠变性真皮中的表达规律；深入研究miR-199a-5p在热损伤成纤维细胞、miR-126在热损伤人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)转归中的作用,并探讨其可能的机制。方法1.收集深二度烧伤患者的变性真皮及配对正常皮肤,标本收集时间均为患者烧伤后第四天,采用高通量miRNA芯片技术初步筛选出变性真皮较正常皮肤差异表达的miRNAs。在另一组标本中应用QRT-PCR技术检测部分差异表达的miRNAs,验证芯片结果的准确性。使用生物信息学方法预测其靶基因以及对变性真皮可能起保护作用的信号通路。筛选出与芯片结果一致并且在细胞增殖和迁移中发挥重要作用的miRNAs (miR-199a-5p和miR-126)进行下一步实验。2.建立大鼠深二度烫伤模型,检测miR-199a-5p和miR-126在大鼠变性真皮恢复不同时间(烫伤后1天、3天、5天、7天、14天)的表达情况,以大鼠正常皮肤做为对照。3.建立成纤维细胞热损伤模型(52°,30s),应用QRT-PCR技术检测miR-199a-5p在成纤维细胞热损伤后恢复不同时间(损伤2h、24h、48h)的表达情况,以正常成纤维细胞做为对照。成纤维细胞转染miR-199a-5p模拟物和抑制物后进行热损伤预处理,采用MTT法、细胞划痕试验及Transwell实验检测miR-199a-5p对热损伤成纤维细胞增殖迁移能力的影响。4.建立HUVECs热损伤模型(52°,30s),应用QRT-PCR技术检测miR-126在HUVECs热损伤后恢复不同时间(损伤2h.12h.24h)的表达情况,以正常HUVECs做为对照。HUVECs转染miR-126模拟物和抑制物后进行热损伤预处理,采用MTT法、细胞划痕试验及Transwell实验检测miR-126对热损伤HUVECs增殖迁移能力的影响。结果1.经miRNA芯片检测发现,烧伤患者的变性真皮相对正常皮肤差异表达的miRNAs有66个,其中34个显著下调,32个显著上调,上调比较明显的有miR-223、miR-320c,下调比较明显的是miR-203、 miR-126、miR-199a-5p。通过生物信息学方法对差异表达的miRNAs进行预测,发现16个与创面修复密切相关的信号通路(如Apoptosis、 Calcium signaling pathway、Cell adhesion molecules、Cell cycle),它们可能在变性真皮转归中发挥重要作用。2.动物实验结果显示：miR-199a-5p在大鼠变性真皮中早期呈低表达,3天降低最明显,之后不断升高,于第7天基本恢复正常；miR-126在大鼠变性真皮中也明显低表达,但于第5天基本恢复正常,之后继续升高,第14天增高为正常皮肤的5倍。3.成纤维细胞热热损伤后24小时miR-199a-5p的表达量降低为正常成纤维细胞的10%,于48小时基本恢复正常。成纤维细胞分别转染miR-199a-5p模拟物和抑制物后进行热损伤预处理,MTT结果显示：与对照组相比,miRNA-199a-5p抑制物组的细胞生长明显较快(P<0.05),在热损伤后48小时、72小时表现均明显；细胞划痕实验显示：miRNA-199a-5p抑制物组的细胞迁移较快,迁移距离较远(P<0.05); transwell实验结果显示：miRNA-199a-5p抑制物组的细胞迁移数量明显高于对照组(P<0.05)。而miRNA-199a-5p模拟物组各项实验数据与对照组无统计学差异(P>0.05)。4. HUVECs热损伤后2小时miR-126的表达量降到正常HUVECs的40%,但是12小时便升高到正常HUVECs的2倍,24小时达到正常HUVECs组的7倍。HUVECs转染miR-126模拟物和抑制物后进行热损伤预处理,MTT结果显示：与对照组相比,miRNA-126模拟物组细胞的生长明显较快,尤其在24小时、48小时表现明显(P<0.05)；细胞划痕实验显示：miRNA-126模拟物组细胞迁移较快,迁移距离较远；transwell实验结果显示：miRNA-126模拟物组细胞迁移数量明显多于对照组(P<0.05)。而miRNA-199a-5p抑制物组实验数据与对照组无明显差异(P>0.05)。结论1.筛选出烧伤患者变性真皮较正常皮肤差异表达的miRNAs,并预测出Apoptosis、Calcium signaling pathway、Cell adhesionmolecules、Cell cycle等16个对变性真皮可能起保护作用的信号通路,为进一步探讨变性真皮转归的机制提供了新的思路。2. miR-199a-5p和miR-126在大鼠变性真皮中的表达均呈时间依赖性改变。损伤早期miR-199a-5p和miR-126均表达下降、然后逐渐恢复正常,不同的是损伤后期miR-126的表达明显高于正常皮肤。3.成纤维细胞热损伤早期miRNA-199a-5p的表达量下降,后期恢复正常。miRNA-199a-5p的低表达能促进热损伤成纤维细胞的增殖及迁移。4.HUVECs热损伤早期miR-126的表达量降低,然后恢复正常,后期表达量明显升高。miR-126高表达能增强热损伤HUVECs的增殖及迁移能力。