目的：　　近年来，组织工程材料的表面处理的应用研究越来越受到重视，其中材料表面化学性是调控材料表面细胞生物学行为和基因表达的重要因素。已有实验证明材料表面不同化学官能团能调控如成骨样细胞、成纤维细胞、肌细胞的命运;也可调控间充质干细胞、人脂肪来源间充质干细胞、鼠神经干细胞的分化。由于现有技术可以很方便地将化学官能团添加在人工合成的细胞外基质(例如:PLA，PGLA)的侧链上，所以研究者可以有目的地将特定的化学官能团添加于人工合成材料上。但选择何种化学官能团作为骨组织工程材料的表面处理的官能团？以及化学官能团影响骨组织工程种子细胞生物学行为的机理都没有明确。　　本实验采用SAMs技术制备不同化学官能团的体外模型，筛选可以用作骨组织工程材料表面处理的化学官能团;初步解释化学官能团影响接种于其表面的间充质干细胞成骨分化能力的机理。本课题所得实验数据将为应用化学官能团作为生物材料表面处理方法提供理论依据。　　实验方法:　　一、应用SAMs技术制备不同化学官能团模型　　1、试样制备　　(1)将1cm边长正方形盖玻片或直径6cm圆形玻璃片在双氧水和浓硫酸混合溶液(1∶3)中清洗2次后，ddH2O清洗，干燥过夜。　　(2)应用离子束溅射(IBS)技术在材料表面生长沉积钛过渡层(厚度10nm);然后再生长40nm厚度的Au(111)层，获得表面均匀、平整的镀金硅片（简称金片）;ddH2O冲洗、储存。　　(3)实验开始前，分别将硫醇(-OH，-COOH，-NH2，-CH3)加入无水乙醇中，配成1mM的硫醇溶液（4℃避光储存），然后将金沉积膜沉浸在不同的1mM硫醇溶液中过夜(＞2h)　　(4)取出金沉积膜，用75％乙醇与无菌ddH2O反复冲洗。　　2、接触角分析　　应用OCA20静滴接触角/界面张力测量仪（Dataphysics，Germany）分别测量4种化学官能团材料表面的接触角，每种重复测量5次，进行拍照并分析数据。　　3、AFM原子力显微镜　　在空气中、接触模式下，应用AFM显微镜（MFP-3D-S，Asylum Research，USA）检测不同化学官能团模型的微观形貌。　　4、XPS能谱分析　　应用碳(284.8 eV)作为标记物，采用Axis Ultra(UK)系统检测，X射线光斑尺寸为700μm×300μm的区域，穿透深度2-3 nm，光源为Al靶Kα射线。根据能谱图中的特征谱线的位置进行材料表面的元素分析。　　二、筛选可以促进BMSCs成骨分化的化学官能团　　1、细胞培养　　抽取4个月左右的新西兰兔骨髓，加入等比例Percoll密度梯度分离液，分离离心获得单个核细胞层后，加入完全培养液培养。原代培养约10-12天，当细胞生长至80-90％融合时按1∶2比例常规传代，4代以内细胞用于后续实验。　　2、CCK-8检测　　(1)依照硫醇的不同将实验组分为4组，分别为:-NH2组、-OH组、-COOH组、-CH3组。将镀金片切割成边长1cm的正方形，置于24孔板中，应用不同硫醇溶液浸泡镀金片2h后，去除硫醇溶液，PBS冲洗3次，75％酒精浸泡消毒2h后备用。　　(2)实验采用兔BMSCs细胞，在-NH2组、-OH组、-COOH组、-CH3组上分别接种细胞悬液（5×104 cells/cm2密度）。在接种后1、3、5、7天取出实验材料，转入新的24孔板中，每孔加入生长培养基300ul（含有30ul CCK-8），继续孵育3h。应用酶标仪读取450nm波长的吸光度值（O.D值）。　　3、免疫荧光显微镜形态学观察　　实验分组与细胞接种方法（密度为1×104 cells/cm2）同上，在接种后1、3天取出实验材料，4％多聚甲醛固定，0.1％ Triton X-100透膜10min，山羊血清室温封闭。用FITC-Phalloidin、anti-vinculin、Alexa Fluor(R)594 conjugated goatanti-mouse IgG(H+L)(Invitrogen，USA)和DAPI于室温下避光染色。应用激光共聚焦显微镜于340nm、488nm、594nm波长下激发荧光，观察细胞粘附与伸展情况，进行图像采集。　　4、Real-Time RT-PCR检测Cbfα1与ALP mRNA的相对表达　　(1)实验分组与细胞接种方法（密度为5×104 cells/cm2）同上，于培养1、3、5、7、10、14天取出实验样品，提取mRNA;紫外分光光度仪测定A260/A280比值，确定其浓度和纯度，并根据A260测定值调整RNA标准浓度为1ug/ul分装，-80℃保存。　　(2)应用PrimeScriptTM RT reagent Kit将mRNA转换为cDNA，逆转录反应条件:37℃15min，85℃5sec。　　(3)应用MxPro-Mx3000扩增仪进行两步法PCR扩增反应，反应条件:95℃、10sec;60℃、40sec，共40个循环，检测Cbfα1与ALP的表达。　　(4)反应结束后分别测定每个样品目的基因和GAPDH mRNA的CT值，采用Livak法(2-ΔΔct法)计算目的样品相对于校准样本目标基因的表达比率，进行样品间相对表达水平的比较。　　(5)用SPSS11.5软件对各组数据进行单因素方差分析，P＜0.05为有统计学差异。　　三、-NH2官能团促进BMSCs的成骨分化过程中涉及的ERK1/2通路　　1、细胞培养　　同论文二。　　2、Real-Time RT-PCR检测integrinβ1、α5、αV的相对表达　　(1)依照硫醇的不同将实验组分为:-NH2与-CH3组。将镀金片切割成边长1cm的正方形，置于24孔板中，应用不同硫醇溶液浸泡镀金片2h后，去除硫醇溶液，PBS冲洗3次，75％酒精浸泡消毒2h后备用。细胞接种同论文二(4)。　　(2)于培养5、10、15、30min取出实验样品，提取mRNA;紫外分光光度仪测定A260/A280比值，确定其浓度和纯度，并根据A260测定值调整RNA标准浓度为1ug/ul分装，-80℃保存。　　(3)应用PrimeScriptTM RT reagent Kit将mRNA转换为cDNA，逆转录反应条件:37℃15min，85℃5sec。　　(4)应用MxPro-Mx3000扩增仪进行两步法PCR扩增反应，反应条件:95℃、10sec;60℃、40sec，共40个循环，检测integrinβ1、α5、αV的表达。反应结束后分别测定每个样品目的基因和GAPDH mRNA的CT值，采用Livak法(2-ΔΔct法)计算目的样品相对于校准样本目标基因的表达比率，进行样品间相对表达水平的比较。　　(5)用SPSS11.5软件对各组数据进行单因素方差分析，P＜0.05为有统计学差异。　　3、Western Blot检测FAK、ERK的活性表达　　(1)实验分组与细胞接种同论文三(2)。　　(2)细胞总蛋白的提取与定量　　于培养5、15、30、45min和1、3、5、7、10、14d时收集细胞，提取细胞总蛋白。采用BCA protein assay(Pierce，USA)试剂盒进行蛋白定量。　　(3)蛋白上样及电泳:准确吸取80ug蛋白质及15ul蛋白Marker，加入相应比例的SDS凝胶上样缓冲液(6×loading Buffer)后上样于5％SDS-PAGE浓缩胶及10％SDS-PAGE分离胶上，带溴酚蓝电泳至凝胶的底部时停止电泳。　　(4)转膜与封闭:应用“三明治”法转膜。　　(5)抗原抗体杂交孵育:分别用兔FAK单克隆抗体、兔p-FAK单克隆抗体(Tyr397)、兔ERK1/2单克隆抗体、兔p-ERK1/2单克隆抗体(Thr202/204)(1∶1000稀释)和GAPDH抗体（1∶300稀释）孵育，4℃杂交过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（1∶300稀释），室温下孵育2h。　　(6)底物显色测定:显色剂显色后，凝胶成像仪分析。　　4、应用PD98059验证ERK1/2通路的作用　　(1)实验分组与细胞接种同论文三(2)。在细胞接种时分别加入0、10、25、50uM的PD98059　　(2)于接种10d时收集细胞，收集后分别提取各组mRNA与细胞总蛋白。　　(3) Real time RT-PCR同论文二(4); Western blot同论文三(3)。　　实验结果：　　一、应用SAMs技术制备不同化学官能团模型　　1、接触角分析　　-CH3的疏水性较强，接触角大于110°;-NH2与-COOH的接触角分别为64.2±1.5、29.4±1.0;-OH表现最亲水，接触角为13.5±0.5。　　2、AFM原子力显微镜　　不同化学官能团模型表面具备相同的表面结构。　　3、XPS能谱分析　　不同化学官能团模型具备相同的结合能峰，证明不同化学官能团模型具备相同的元素构成。　　二、筛选可以促进BMSCs成骨分化的化学官能团　　1、CCK-8检测　　在不同化学官能团模型上，细胞的增值情况是不同的，各组细胞随着时间的延长呈现不同的增殖状态。在4组中，增殖情况最差的是-CH3组;其它3组与-CH3组相比较，增殖情况均强于-CH3组。　　2、免疫荧光显微镜形态学观察　　在各化学官能团模型上，细胞在3d时的伸展均优于1d;多数细胞呈多边形外观;可以清楚地看见肌动蛋白纤维束与FAK结构。-NH2与-OH模型上细胞伸展良好、伸展程度类似;有典型的伪足伸出;细胞骨架中的微丝结构清晰，顺着细胞的伸展方向排列有序，细胞之间形成良好的交通。-CH3与-COOH组细胞细胞形态不均匀，1d时可见圆形贴壁但未伸展的细胞。　　3、Real-Time RT-PCR检测Cbfα1与ALP mRNA的相对表达　　检测BMCSs细胞在4种化学官能团表面1、3、5、7、10、14d时的实时定量PCR骨相关基因的表达。与-CH3组相比，Cbfα-1 mRNA的表达在-NH2组的7、10、14d表达明显升高，二者有显著性差异(P＜0.05);在-OH组10d与-COOH组7、10d，Cbfα-1 mRNA的表达均有升高(P＜0.05)，但增高幅度没有-NH2组明显。与-CH3组相比，ALP mRNA的表达在-NH2表面7、10、14d时表达明显明显升高，二者有显著性差异(P＜0.05)。在-OH组10d与-COOH组10、14d，ALP mRNA的表达均有升高，但增高没有-NH2组明显。　　三、-NH2官能团促进BMSCs的成骨分化过程中涉及的ERK1/2通路　　1、Real-Time RT-PCR检测integrinβ1、α5、αV的相对表达　　检测BMCSs细胞在2种化学官能团表面5、10、15、30min时的实时定量PCR粘附因子基因的表达。在-NH2组，Integrinβ1、α5、αV均优先表达、表达幅度均强于-CH3组。-NH2组的Integrinβ1表达在15min达到峰值，且明显高于-CH3组(P＜0.05); Integrinα5的表达在30min达到峰值，且在5、15、30min的表达明显高于-CH3组(P＜0.05); IntegrinαV的表达在30min达到峰值，且在15、30min的表达明显高于-CH3组(P＜0.05)。结果说明-NH2可以促进Integrinβ1、α5、αV的表达。　　2、Western Blot检测FAK、ERK的活性表达　　检测BMCSs细胞在2种化学官能团表面的FAK与ERK的活性表达。结果显示:在两组细胞中，细胞内源性的FAK总蛋白水平无变化，但化学官能团影响了FAK的磷酸化水平;-NH2可以使FAK的磷酸化时间提前，促进FAK复合体的形成。在两组细胞中，细胞内源性的ERK总蛋白水平无变化，-NH2不能提前ERK的磷酸化时间，但-NH2可以促进ERK蛋白的磷酸化。　　3、应用PD98059验证ERK1/2通路的作用　　(1)通过Western Blot检测了PD98059作用后的第10d的BMSCs的ERK1/2总蛋白水平及磷酸化水平。结果显示:在两组细胞中，细胞内源性的ERK1/2总蛋白水平无变化;PD98059抑制了ERK1/2的磷酸化水平，且这种抑制作用呈剂量依赖性。从图中还可以观测到:在0uM PD98059时，-NH2组ERK1/2的磷酸化水平明显高于-CH3组;在应用10uM PD98059时，两组的ERK1/2磷酸化水平均被大部分抑制;而在应用25、50uMPD98059时，基本检测不到磷酸化的ERK1/2。　　(2)通过Real Time RT-PCR法检测了PD98059作用后第10d的BMSCs的Cbfα1与ALP的mRNA表达。结果显示:在两组细胞中，PD98059均抑制了Cbfα1与ALP的mRNA表达，且这种抑制作用呈剂量依赖性。在0uMPD98059时，-NH2组Cbfα1与ALP的mRNA水平明显高于-CH3组(p＜0.05);在应用10uMPD98059时，两组的Cbfα1与ALP的mRNA水平水平均被抑制(p＜0.05);在应用25、50uMPD98059时，两组的Cbfα1与ALP的mRNA水平均被进一步抑制。但与ERK1/2的结果不同，PD98059并没有完全抑制Cbfα1与ALP的mRNA水平，而是抑制50％的水平后，没有进一步下降。　　结论：　　1、通过SAMs技术，在Si基玻璃片上成功制备出表面化学元素构成一致、表面结构相同的不同化学官能团的单分子膜实验模型。不同化学官能团模型的表面接触角不同，按照表面接触角排序:-OH＜-COOH＜-NH2＜-CH3。甲基的接触角最大，最疏水;羟基的接触角最小，最亲水。　　2、通过CCK-8实验证明接种在-NH2组表面的细胞增值能力最强;免疫荧光实验表明-NH2组表面的细胞早期黏附及细胞伸展良好;Real time RT-PCR结果显示-NH2组表面的细胞骨形成转录因子的mRNA表达明显增高，综合分析后可以在4种化学官能团中选出-NH2为可促进BMSCs成骨分化的材料表面处理官能团　　3、-NH2官能团是通过ERK1/2信号通路起到促进BMSCs的成骨分化的作用的，但还有其它信号通路介导-NH2官能团促进BMSCs的成骨分化。