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目的:寨卡病毒（ZIKV）是一种蚊虫传播的病毒,是一种正链RNA病毒。被寨卡病毒感染的人中有一小群人患有症状,但是寨卡病毒具有嗜神经性和致畸性,严重能够导致严重先天畸形（小头畸形）的增加,也可引起成人神经性格林巴利综合征,严重威胁人类健康[1-3]。针对寨卡病毒的抗病毒药物筛选和预防寨卡病毒感染的实质性研究正在广泛进行,但目前还没有公认的获得批准的治疗方法,也没有针对抗寨卡病毒药物的特效药。近些年,从中草药中提取的化合物可能为潜在的抗寨卡病毒感染的治疗提供机会,为此本课题主要通过开展实验来研究苦豆碱对寨卡病毒的抗病毒作用及其机制研究。方法:1、苦豆碱体外抗寨卡病毒活性研究寨卡病毒感染Vero、A549、U251细胞48h,使用qRT-PCR方法来检测不同细胞内寨卡病毒RNA含量;通过蛋白免疫印迹法（Western blot）检测寨卡病毒NS5和E蛋白表达,利用免疫荧光实验检测苦豆碱对寨卡病毒蛋白的影响,并结合空斑实验检测苦豆碱对子代病毒数量的影响,从而验证苦豆碱的抗病毒活性。2、苦豆碱抑制寨卡病毒复制的机制研究细胞感染病毒后在不同时间（-2,0,1,2,4,6,10 hpi）加药,分别使用qRT-PCR方法来检测不同细胞内寨卡病毒RNA含量、利用空斑的方法来检测子代寨卡病毒数目,结合蛋白免疫印迹法检测寨卡病毒NS5和E蛋白表达,来验证苦豆碱对寨卡病毒复制阶段的的影响。苦豆碱对Vero细胞寨卡稳定性结合、进入、复制、释放和稳定性的抑制作用研究中,结合实验用寨卡病毒（MOI=0.1）接种于含或不含苦豆碱（6.25、12.5、25μM）的Vero细胞单层上,4℃孵育1h,用PBS轻轻清洗细胞表面两次,再更换无血清新鲜培养基,再置于培养箱（条件:5%CO2,37℃）孵育48h。用RT-qPCR和WB分别检测细胞内病毒RNA水平和蛋白水平。将含寨卡病毒（MOI=0.1）的新鲜培养液加入Vero细胞于4℃孵育1h后,用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次,再加入含或不含苦豆碱（6.25、12.5、25μM）的新鲜培养液,在置于培养箱（条件:5%CO2,37℃）孵育1h。此后,再用PBS轻轻清洗细胞表面两次,更换无血清新鲜培养基。孵育48小时后,用RT-qPCR和WB分别检测细胞内病毒RNA水平和蛋白水平。复制和释放阶段,用MOI=0.1的寨卡病毒在4℃下感染细胞1h,然后在37℃下孵育1h。当寨卡病毒进入细胞并加入指定浓度的苦豆碱时。孵育1d后,收集细胞裂解液,用RT-qPCR检测病毒RNA复制。进行细胞热转变分析实验（CETSA）阐明苦豆碱与寨卡病毒NS5蛋白的相互作用。用Autodock软件分子对接技术对苦豆碱与RdRp进行分子对接预测,说明苦豆碱与Rd Rp的可能存在结合位点。3、苦豆碱对STAT1活性和ISG表达的影响用寨卡病毒感染A549细胞,在无病毒培养基洗净后,加入不同浓度苦豆碱溶液（12.5、25μM）。测定48hpi时p-STAT1（Tyr701）、总STAT1、E蛋白和内参蛋白的蛋白水平。用干扰素-β（50 ng/mL）或（25μM）与THP-1细胞共同孵育,48h后测定p-STAT1（Tyr701）、总STAT1和肌动蛋白水平。采用定量RT-qPCR方法检测ISG15、ISG54、IFITM1、IFITM3的mRNA水平以及IL-8、IL-1β和肿瘤坏死因子-α的表达水平。结果:1.苦豆碱体外抗寨卡病毒活性研究（1）苦豆碱在Vero,A549,U251细胞中的CC50均大于200μM（苦豆碱200μM时对细胞保护率仍然90%以上）。（2）苦豆碱在Vero,A549,U251细胞中的EC50分别为2.98,5.564,6.036μM。（3）根据免疫荧光实验和蛋白免疫印迹实验结果可知苦豆碱抑制寨卡病毒蛋白的形成,当浓度大于25μM时完全抑制病毒蛋白的形成。2.苦豆碱抗寨卡病毒机制研究（1）由不同时间给药实验可知苦豆碱作用于病毒感染后期。（2）4℃和37℃实验证明苦豆碱不主要通过阻断病毒的结合、进入以及预防作用而具有抗寨卡病毒活性,而主要通过干扰寨卡病毒的复制、释放阶段来抑制寨卡病毒活性。（3）根据CETSA实验结果,加入苦豆碱后NS5 Tagg值从44.6℃增加到47.8℃,增加蛋白稳定性。（4）体外酶活实验证明苦豆碱抑制RdRp活性。3.苦豆碱对STAT1活性和ISG表达的影响（1）苦豆碱可以降低由寨卡病毒引起的RIG-I和MDA5的上调。（2）以DNA病毒受体STING（由TMEM173编码）,作为阴性对照,苦豆碱可以降低由寨卡病毒引起的IFIH1和DDX58的表达,对TMEM173的表达无明显影响。（3）寨卡病毒感染增强了STAT1的磷酸化水平,而苦豆碱可逆转这一现象。结论:本研究发现体外实验证明苦豆碱具有显著抗寨卡病毒活性,通过抑制RdRp活性抑制寨卡病毒复制,发挥抗寨卡病毒作用。并能降低由寨卡病毒引起的炎症。我们的研究证明了苦豆碱抗寨卡病毒活性和抗寨卡病毒机制的初步研究,为苦豆碱作为抗寨卡病毒候选药物提供依据以及为阐明苦豆碱抗寨卡病毒机制提供基础。