研究背景和目的肿瘤是人类健康的最大危害因素之一,随着世界人口的增长和老龄化的加剧,全球癌症负担持续增加。据GLOBOCAN估计,2008年大约有1270万新发癌症病例和760万死亡病例。结直肠癌作为男性中第三大常见的肿瘤,女性中第二常见的肿瘤,在过去的几年里,伴随外科手术、放化疗、分子靶向生物治疗的进步和疾病的早期检测,结直肠癌的生存预后得到了显著提高。但结直肠癌患者的长期预后仍然令人失望,特别是晚期大肠癌的5年总生存率只有19%或更低。已证实结直肠癌的发生与诸多癌基因和抑癌基因及其产物的表达或结构异常密切相关,从细胞分子水平深入研究结直肠癌的发生发展机制,特别是从基因水平上研究寻找结直肠癌相关基因,对结直肠癌的诊断、治疗和预防发挥着重要的作用。因此,我们首先利用基因芯片技术检测了4例结直肠腺癌原发肿瘤组织和配对的4例腹膜转移组织全基因组mRNA表达水平的差异,通过与原发肿瘤组织的比较,筛选出表达差异显著的候选基因。鉴于文献学习和预实验结果,最终我们把注意力集中在了基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(Tissue inhibitor of metalloproteases1, TIMP1)基因。接着,我们应用免疫组织化学方法检测了112例结直肠癌组织中TIMP1蛋白的表达,结果发现TIMP1蛋白在结直肠癌组织中亦高表达。于是探讨了TIMP1的表达水平与大肠癌标本的临床病理资料、患者生存期的关联性。为进一步验证TIMP1在结直肠癌发生发展过程中的作用,应用MTT细胞生长曲线、克隆形成、细胞转移等实验方法检测了TIMP1基因对结直肠癌细胞的增殖、肿瘤球形成能力、细胞转移侵袭能力和大肠癌细胞对5-FU药物敏感性的影响。肿瘤侵袭转移复发作为导致癌症患者最常见的死亡原因,因此我们深入探讨了TIMP1对结直肠癌细胞上皮-间充质转化的影响及对EMT相关转录因子的表达水平的影响。此外,通过Targetscan, miRanda和PicTar4三个miRNA生物信息分析网站,预测了靶向调控TIMP1表达的潜在miRNAs,三种预测结果均显示miR-618同TIMP1的3’UTR存在互补的碱基序列结合位点。于是我们应用双荧光素酶报告基因和Western blot等分子生物学方法,进一步研究了miR-618对TIMP1表达水平的调控及机制。原位杂交和免疫组织化学方法检测分析miR-618和TIMP1在结直肠癌组织表达量及其相互关联性。通过上述研究,让我们深入了解了TIMP1在结直肠癌的发生发展中发挥的致癌作用及其涉及的分子调控机制,为早期诊断、治疗和预防结直肠癌提供了新的策略和理论依据。方法第一章选取结直肠癌伴腹膜种植转移病人4例,提取原发肿瘤组织和腹膜转移组织RNA,高通量基因芯片技术对结肠癌样本进行基因表达谱分析；免疫组织化学方法检测TIMP1在结直肠癌组织中的表达模式,并评价TIMP1表达水平与标本的临床病理资料的关联性,分析其表达水平与结直肠癌患者生存期预后的关系。第二章鉴于TIMP1与肿瘤大小、淋巴转移、临床分期及患者生存期具有显著相关性,本课题进一步深入研究了TIMP1对结直肠癌细胞的生物学行为的影响。首先,针对TIMP1基因的开放读码框序列设计了si-RNA。转染si-RNA至SW-620细胞中,采用Western blot和免疫荧光评估si-RNA干扰TIMP1基因表达的效率。接着,通过MTT生长曲线、克隆形成实验和细胞转移实验、重组基底膜侵袭实验检测了TIMP1表达水平的变化对结直肠癌细胞的增殖、肿瘤球形成及细胞转移侵袭能力的影响。同时MTT法检测了si-TIMP-1-SW-620细胞对5-FU耐药性的影响。第三章针对TIMP1能够促进结直肠癌细胞转移侵袭的特征,利用RT-PCR和Western blot检测了si-RNA对MT1-MMP表达水平的作用。同时为了验证TIMP1对结直肠癌细胞上皮-间充质转化的作用,我们应用Western blot测定了TIMP1的表达下调对上皮标记物E-cadherin和间充质标记物Vimentin表达量的影响。为进一步明确引起上皮-间充质转化的机制,Western blot检测了与EMT相关的标记物ZEB1、ZEB2和Saill。第四章应用Targetscan、miRanda和PicTar4三个生物信息分析网站,预测了可能调控人源TIMP1表达的潜在miRNAs。三个网站预测结果均显示miR-618同TIMP13’UTR有结合位点。将miR-618转染至SW-620细胞，QRT-PCR检测miR-618在miR-618/SW-620和NC/SW-620两处理组细胞中的表达水平。同时将miR-618转染至SW-620细胞,Western blot和免疫荧光检测miR-618/SW-620和NC/SW-620两组细胞的TIMP1蛋白表达情况。构建含有TIMP1编码区全长序列的双荧光报告基因载体(pTIMP1-CDS),测序验证插入片段的序列正确与否。将pTIMP1-CDS质粒转染到SW-620和293T细胞并分别经miR-618模拟物或抑制物处理,应用双荧光报告基因检测经不同处理后的细胞的荧光素变化。应用原位杂交、免疫组织化学方法和QRT-PCR分别检测38例结直肠癌组织中TIMP-1和miR-618表达,并对结直肠癌组织中miR-618和TIMP-1表达水平相关性作分析。统计学处理采用统计软件SPSS13.0对实验结果进行统计学处理和分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。TIMP1的表达与临床病理资料的关系采用卡方检验分析；生存分析采用Kaplan-Meier法,log-rank检验比较生存差异。肿瘤球数量的比较采用两独立样本T检验。临床样本中miR-618和TIMP1关系采用卡方检验分析。P<0.05被认为有统计学差异。结果第一章利用高通量基因芯片技术对原发肿瘤组织和腹膜转移组织样本进行基因表达谱分析,结果发现在腹膜转移组织中表达上调大于4倍的基因有24个,其中TIMP1基因在腹膜转移组织中明显高于原发肿瘤组织,高4.49倍。应用免疫组织化学方法检测112例结直肠癌组织中TIMP1蛋白表达,结果显示TIMP1在癌细胞浆中表达,阴性表达10例(8.9%),低表达26例(23.2%),中度表达42例(37.5%),强表达34例(30.4%)。通过免疫组化结果结合临床资料,分别分析了肿瘤大小、淋巴转移、临床分期与TIMP1表达的关系,发现TIMP1表达高低与肿瘤大小(P＝0.000)、淋巴转移(P=0.001)、临床分期(P=0.004)具有显著相关性。通过Kaplan-Meier法分析了TIMP1的表达与结直肠癌患者生存预后的关系,112例结直肠癌患者全部接受了随访,结果显示,TIMP1的表达越高,中位生存时间越短；相反,表达越低,中位生存时间越长。第二章siRNA-TIMP1小分子转染SW-620细胞,Western blot和免疫荧光检测siRNA对TIMP1干扰效率,结果显示：相对于对照组,转染siRNA-TIMP1的SW-620细胞明显低表达TIMP1蛋白。采用MTT法连续4d观察si-TIMP1/SW-620细胞增殖速度,结果显示从第二天开始低表达TIMP1的SW-620细胞增殖速度减慢；表明si-TIMP1/SW-620较NC/SW-620细胞增殖能力弱。以不同浓度梯度的5-FU分别作用于NC/SW-620和si-TIMP1/SW-62072h,结果显示两组细胞IC50有明显差异,si-TIMP1/SW-620较NC/SW-620耐药性明显降低。进一步将NC/SW-620和si-TIMP1/SW-620细胞分别培养在无血清培养基中,肿瘤球生长5d后,两独立样本T检验比较两组细胞肿瘤球直径存在显著性差异(t=-13.929,P=0.000)；第三章RT-PCR和Western blot分别检测NC/SW-620和si-TIMP1/SW-620细胞MT1-MMP的表达水平,结果显示si-TIMP1/SW-620细胞较NC/SW-620细胞明显低表达MT1-MMP。Western blot检测NC/SW-620和si-TIMP1/SW-620细胞上皮标记物E-cadherin和间充质标记物Vimentin,结果显示si-TIMP1/SW-620细胞较NC/SW-620细胞可提高E-cadherin表达,降低Vimentin表达。Western blot检测NC/SW-620和si-TIMP1/SW-620细胞EMT标记物ZEB1、 ZEB2和SANI1,结果显示si-TIMP1/SW-620细胞较NC/SW-620细胞ZEB1, ZEB2和SANI1表达降低。第四章鉴于常规的miRNA靶基因预测方法,通过Targetscan, miRanda和PicTar4三个miRNA生物信息网站,预测可能调节TMP1的潜在miRNAs,三种预测结果均显示miR-618同TIMP13’UTR有结合位点,miR-618可能通过结合于TIMP13’UTR调控TIMP1的表达。经Targetscan在线程序分析提示miR-618与TIMP1mRNA的82至88之间区域存在互补结合序列。miR-618转染SW-620细胞,RT-PCR检测miR-618的表达,结果显示：miR-618/SW-620细胞较NC/SW-620细胞明显高表达miR-618。miR-618转染SW-620细胞,Western blot和免疫荧光检测TIMP1表达,结果显示相对于对照组,转染miR-618的SW-620细胞明显低表达TIMP1蛋白,提示miR-618与TIMP1之间存在着调控关系,miR-618可抑制TIMP1表达。于是我们构建了pTIMPl-CDS,将pTIMPl-CDS转染到SW-620和293T细胞并分别加入miR-618模拟物或抑制物处理48小时后,双荧光报告基因检测技术检测细胞总蛋白的荧光素变化,发现miR-618mimics作用这两种细胞后海肾荧光素酶的活性明显受抑制,仅为对照组的50%左右；而miR-618inhibitor作用后海肾荧光素酶的活性呈现不同程度的增加。这些结果表明miR-618通过作用于pTIMP1-CDS片段,影响了海肾荧光素酶的表达。应用原位杂交、免疫组织化学方法和QRT-PCR分别检测38例结直肠癌组织中TIMP-1和miR-618表达水平,Fisher确切概率法检验结果显示miR-618+/TIMP-1-同miR-618+/TIMP-1+病例数量具有统计学差异(P=0.000)。结论1结直肠癌腹膜转移组织中表达上调大于4倍的基因有24个,其中包括TIMP-1;TIMP-1蛋白在结直肠癌组织中表达亦明显上调,其表达水平与肿瘤大小、淋巴转移、临床分期密切相关,并与患者生存预后存在关联,预示其可能成为判断结直肠癌进展和预后的理想标志物；2沉默TIMP1的表达可显著抑制SW-620结肠癌细胞的增殖、转移、侵袭和肿瘤球形成能力,提高SW-620结肠癌细胞对5-FU的敏感性；进一步分子生物学实验发现,干扰TIMP1的表达可抑制SW-620细胞MT1-MMP蛋白、间充质标记物Vimentin及EMT标记物ZEB1、ZEB2和SANI1的表达,促进上皮标记物E-cadherin的表达；3miR-618可靶向作用于TIMP13’UTR调控TIMP1蛋白的表达；此外在结肠癌标本中,miR-618+/TIMP-1-同miR-618+/TIMP-1+病例数量具有统计学差异。本研究有助于揭示结肠癌发生发展的分子机制及为结肠癌的早期诊断、预防和治疗提供理论依据和策略。