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背景:肿瘤是严重威胁人类生命与健康的疾病,也是我们持之以恒想要攻克的难题。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)在体外较易获得,具有很强的自我更新以及向损伤组织或肿瘤炎症部位迁移趋化的能力,赋予了它将治疗药物靶向病灶的潜力,因此在细胞治疗方面备受青睐。然而主要由肿瘤组织内的细胞、细胞因子以及细胞外基质等构成的肿瘤微环境非常复杂,肿瘤细胞和间充质干细胞之间可以通过窜话(cross-talk)的方式相互影响,这有让间充质干细胞发生瘤化的可能性,这给干细胞作为靶向治疗载体的临床安全应用造成阻碍。信号转导和转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT3)作为核内转录因子,主要对基因的转录进行调控,是信号转导和转录活化因子家族当中不可或缺的成员之一。在正常细胞中,STAT3的活化过程受到严格控制,然而若STAT3被持续激活,可介导细胞的恶性转化和肿瘤的生成,因而被确认为癌基因。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类由20-25个核苷酸组成的非编码单链小分子RNA,研究表明,miRNAs在肿瘤的发生发展中扮演着十分重要的角色,在转录后水平调控基因的表达。在肿瘤微环境中,肿瘤细胞可以通过释放miRNAs的方式从表观遗传角度迅速改变细胞的性能,而并不改变基因的核苷酸序列,本实验以期通过验证miRNA对STAT3的调控关系,来为我们探究干细胞瘤化提供新的研究思路和补充新的证据。目的:本实验旨在通过C6胶质瘤细胞与大鼠骨髓间充质干细胞间接共培养来模拟肿瘤微环境,探究STAT3与BMSCs的瘤样转化是否具有相关性;探索miRNA参与调控STAT3的可能机制。方法:第一部分:将C6胶质瘤细胞与BMSCs进行间接共培养2周,通过CCK-8检测细胞增殖活性、流式细胞术检测细胞周期、软琼脂克隆形成实验检测细胞形成克隆球能力以及裸鼠体内成瘤实验来验证共培养后的BMSCs是否发生瘤化。采用实时荧光定量RT-qPCR和western blot技术检测共培养实验组和对照组BMSCs细胞中STAT3癌基因的表达差异情况。第二部分:利用生物信息在线预测软件Targetscan,miRanda预测可能与STAT3有靶向作用关系的miRNAs,通过RT-qPCR对比共培养组实验组BMSCs与对照组BMSCs中的差异miRNAs表达,挑选miRNA-134-5p进行下一步实验。第三部分:分别将miRNA-134-5p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC转染进BMSCs细胞中,用RT-qPCR和western blot对STAT3的表达进行检测。构建可能含有结合位点的野生型GP-miRGLO-STAT3-WT载体和突变位点GP-miRGLO-STAT3-MUT载体.在HEK293细胞中进行GP-miRGLO-STAT3-WT、GP-miRGLO-STAT3-MUT和miR-134-5p mimics或mimics NC共转染,进行双荧光素报告基因检测。结果:第一部分:BMSCs与C6胶质瘤细胞共培养后,CCK-8检测显示共培养组BMSCs增殖活性明显增强,流式细胞术显示实验组细胞主要处于S、G2期,软琼脂克隆形成实验证实共培养的BMSCs有形成克隆球的能力,而对照组不能形成克隆球,共培养的实验组BMSCs也能在裸鼠体内长成肿块,而对照组无肿块形成。RT-qPCR和western blot显示共培养实验组BMSCs细胞中STAT3癌基因明显高表达。第二部分:Targetscan,miRanda预测与STAT3可能有靶向关系的miRNAs有55个,通过文献回顾,确定6个miRNA为备选,RT-qPCR检测发现共培养组BMSCs细胞中miRNA-134-5p异常低表达,与高表达的STAT3之间可能存在负调控机制,以往的研究中未见报道miRNA-134-5p与STAT3之间存在调控关系,初步确定其为进一步研究对象。第三部分:将miRNA-134-5p模拟物导入细胞后,提高miRNA-134-5p的内源性表达能够抑制STAT3癌基因的mRNA和蛋白的表达。双荧光素酶报告基因检测结果显示与mimics NC组相比,miR-134-5p mimics组中野生型GP-miRGLO-STAT3-WT载体的荧光素酶活性下降(P<0.05),miR-134-5p mimics对突变型GP-miRGLO-STAT3-MUT载体的荧光素酶活性没有明显影响。结论:BMSCs在C6胶质瘤细胞的间接共培养环境中能够出现部分瘤化特性,其中的可能机制是异常降低的miR-134-5p弱化了对癌基因STAT3的靶向调控能力导致的。