军团菌(Legionella)是一种兼性胞内寄生菌,在环境水源中分布甚广,是引起人类军团菌病的重要病原体。目前已确认军团菌有50多个种,70多个血清型,接近20个种有临床分离报道,其中嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)与人类的疾病关系最为密切。自军团菌病暴发以来,已有许多成熟的方法应用于军团菌检测鉴定,但传统的军团菌分离培养法难度大、耗时长；血清学分型只能用于已知菌种的检测；生化表型鉴定分辨率低,重复性差；其它方法如可溶性蛋白电泳、脂肪酸成分分析等,也均存在不足。因此,极需一种快速有效的检测鉴定方法。近年来,与分子生物学技术相结合的酶切分型方法已广泛应用于微生物的检测鉴定,该技术通过对特异性基因片段进行酶切,不仅能与PCR的高灵敏度相结合,而且能为军团菌鉴定提供更为客观、可靠及高效的结果。本论文通过对环境水源和临床痰液标本进行军团菌分离培养、16S rRNA PCR、酶切分型鉴定,再用16S rRNA基因测序分析法对酶切分型结果进行考证,结果如下：为了建立聚合酶链反应-酶切分型快速鉴定军团菌方法,探讨广州地区环境水源军团菌的分布状况。本研究于2008年11月-2009年1月在广州市珠江琶洲段、黄埔村珠江支流和池塘、黄埔古港、白云山水库、天河公园和华南植物园内湖泊,采集水样44份环境水样,用本室改良BCYEa-DGVPC军团菌培养基作培养,对分离菌株同时采用生化反应、16SrRNA PCR、酶切分型及16S rRNA基因测序鉴定。结果显示：在广州地区初分离的115株军团菌可疑菌株,经生化反应和16S rRNAPCR鉴定其中112株为军团菌菌株。再经酶切分型和16S rRNA基因测序鉴定,检出嗜肺军团菌66株,非嗜肺军团菌46株,其中菲氏军团菌20株,戈氏军团菌17株,橡树岭军团菌7株,长滩军团菌2株。比较两种方法对嗜肺军团菌检出率完全一致,说明酶切分型检测嗜肺军团菌具有高度的敏感性和特异性。结果也同时表明,广州地区环境水源军团菌阳性率约为59.1%,以嗜肺军团菌最多(58.9%),且在同一环境水源中存在多种军团菌。为了建立临床痰液标本军团菌分离培养标准检测方法,提高培养阳性率。本研究采集50份新鲜痰液标本,分为两组,一组直接预处理后进行培养,另一组加入标准菌株后再预处理及培养。预处理先液化处理,然后分别采用直接接种、酸处理或热处理后再接种军团菌选择性BCYEa-DGVPC培养基,观察菌落生长情况。根据军团菌生长缓慢及菌落形态和在缺乏L-半胱氨酸的平板、血平板上不生长的特点做初步判断,生化反应及PCR法进行确证。结果显示：50份未加菌的痰液均未分离出军团菌；50份加有军团菌的模拟痰标本直接接种的检出率为58%,其中酸处理的标本检出率为70%,热处理的标本检出率为66%。三种培养方法进行比较,单独的热处理与直接处理相比较并没有统计学差异(P值为0.261),单独的酸处理与直接处理相比较具有统计学差异(P值为0.003),而酸处理和热处理培养阳性结果比较并不具有一致性。说明酸处理和热处理两种方法均可以提高军团菌检出率。其中酸处理可以显著提高军团菌检出率。本研究采集了100份非典型肺炎患者新鲜痰液标本,经16S rRNA PCR、酶切分型和16S rRNA基因测序鉴定。结果显示：100例痰液标本16SrRNA PCR试验阳性13例,经进一步的酶切分型和16S rRNA基因测序鉴定,其中12例为嗜肺军团菌,1例阴性,且酶切分型同16S rRNA基因测序鉴定结果一致。说明酶切分型对临床标本嗜肺军团菌的检测也具有高度的敏感性和特异性。