机体器官或组织遭受缺血、缺氧打击,在恢复血供氧供后不仅不能恢复该器官或组织的结构和功能,反而出现其结构和功能损伤加重的现象被称为缺血灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)。全身各个脏器均可发生IRI,其中肝脏IRI最为常见和严重,肝脏IRI的发生会造成肝功能损伤甚至肝衰竭,严重者出现全身多脏器功能障碍/衰竭,IRI亦会增加移植器官排斥几率,增加肿瘤复发转移机会,直接影响到疾病的预后,故进一步探寻肝脏IRI的发生机制及并据此制定更有针对性的防治措施将对未来肝脏手术及介入治疗的发展起到重要的作用。肝动脉栓塞(transcatheter arterial embolization,TAE)是中晚期肝癌、肝转移癌及部分肝良性肿瘤的常用治疗方法,TAE术后肝功能损伤甚至肝功能衰竭是术后最常见的并发症,但TAE是否会导致IRI的研究极少,TAE导致的肝损伤是否与IRI有关尚不明确。从理论上来说,在TAE术后其同样经历着组织器官缺血-血流恢复的过程,故同样可能出现IRI损伤,但TAE术后没有栓塞血管的立即再通过程,其病理生理过程不同于既往研究的IRI过程。故TAE术后是否存在IRI?其导致的IRI是否与肝功能损伤有关?这些问题都值得被重视及进一步研究。在肝脏IRI的病理过程中,固有免疫细胞如:树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞都扮演了重要的角色。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是目前已知的最重要的抗原递呈细胞,它是连接固有免疫和适应性免疫应答的重要桥梁。DCs存在于大多数的组织器官中,其中包括实质性脏器如肝脏、肾脏、肺脏等,国内外许多研究表明DCs在多种肝脏疾病中发挥了重要的作用。近期研究发现肝脏DCs同样在肝脏IRI的过程中扮演重要角色,但所得出的结论却存在差异性,究其原因可能与DCs群体的高度的异质性相关,对不同来源的DCs如局部定居或循环来源以及局部组织中分化为不同亚群的DCs如pDCs(plasmacytoid dendritic cells)、cDCs(classical dendritic cells)在疾病和各阶段的病程中所发挥的功能不尽相同。DCs可分为几类亚群,其中包括经典DCs、单核细胞来源的DCs和浆细胞样DCs。而经典DCs依据表面标志和功能的不同在非淋巴器官中可进一步分出CD103+DCs这一亚群。CD103+DCs定居于实质性脏器如肝脏、肾脏、肺脏等,数量比例均在局部定居的DCs总群体中占多数,并且既往很多研究指出其参与了多种疾病的病程,在机体的免疫应答中发挥了重要的作用,然而在肝脏IRI中有关CD103+DCs的研究却鲜有报道。因此明确CD103+DCs在肝脏IRI疾病中的变化及所发挥的功能是一个值得深入探讨的课题。在CD103+DCs亚群中具有一些独特的分子标记与组织中其他亚群的DCs细胞有所区分,如转录因子(Batf3、IRF8)和生长因子受体(FMS-like tyrosine kinase 3,Flt3)等。其中Flt3可通过磷酸化活化与其配体(Flt3 ligand,Flt3L)结合发挥作用,对DCs的分化、成熟起到重要的作用,并且相较其他亚群DCs,CD103+DCs的发育和成熟更加依赖Flt3,因此我们推测Flt3/Flt3L是一个可用来调控CD103+DCs功能的靶点。调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)是T淋巴细胞一个重要的亚群,在机体维持免疫稳态中发挥着关键的作用,很多研究中表明增加Treg的表达可以减轻炎症和损伤的程度。相继有研究报道CD103+DCs可诱导初始T细胞向Treg转化,进而发挥其保护性的免疫调节作用有利于疾病的缓解。然而目前通过CD103+DCs活化Treg细胞进而缓解疾病进展的研究多集中在自身免疫性疾病领域,而对于炎症性疾病的作用了解甚少。因此在以炎症为主要发病机制的肝脏IRI疾病中,CD103+DCs所扮演的角色,以及其作用机制都值得进一步去探究,以便明确是否有希望针对CD103+DCs进行靶向调节治疗肝脏IRI。目的1.动态监测肝癌栓塞手术前后SOD、MDA、IL-6、ALT、AST、LDH等与肝IRI相关的指标,分析缺血再灌注指标与肝功能之间的相关性,初步评估肝动脉栓塞术后是否存在IRI并探讨肝功能损伤与IRI相关性;2.通过检测肝脏IRI动物模型中再灌注不同时间点的肝脏组织损伤、肝脏功能、炎症细胞因子及肝脏组织中DCs及DCs亚群CD103+DCs的数量和比例,观察肝脏IRI病程与CD 103+DCs的相关性;3.通过给予流式分选小鼠的CD103+DCs,提前回输至模型小鼠体内,检测经过干预后肝脏功能、组织损伤、炎症细胞因子及CD103+DCs数量、比例的变化,探讨CD103+DCs在肝脏IRI疾病中发挥的作用;4.采用Flt3抑制剂、Flt3L及si-Flt3转染的不同方式在肝脏IRI小鼠模型中干预CD103+DCs上Flt3/Flt3L靶点的表达以调控CD103+DCs的功能。通过动物实验检测肝脏功能、组织损伤、炎症细胞因子、凋亡蛋白表达等指标,进而探讨通过Flt3/Flt3L调控CD103+DCs影响肝脏IRI病程的作用机制;5.采用Flt3抑制剂、Flt3L及si-Flt3体外干预CD103+DCs后与T细胞进行混合淋巴细胞培养,证实CD103+DCs对于Treg增殖、功能的影响;通过体外实验CD103+DCs对肝细胞缺氧复氧模型进行干预,检测肝细胞凋亡变化。探讨CD 103+DCs改善肝脏IRI疾病程度的作用机制。方法按照纳入及排除标准选取因肝癌接受肝动脉化疗栓塞术(TACE)的患者。分别于TACE术前、TACE术后1d、2d、3d早晨抽取患者外周静脉血标本,分别送检检测病人LDH及肝功能指标ALT、AST;氧化应激指标:MDA和SOD;炎性细胞因子水平:IL-6。比较各指标在不同时间点各项指标的变化并比较不同栓塞剂量下肝功能损伤指标、氧化应激指标、炎症指标的差异。SPF级雄性C57BL/6小鼠168只,体重20-25g,设立一期实验(动物模型构建):对照组、假手术组、模型组(Oh、6h、12h、24h亚组),二期实验:对照组、假手术组、阴性对照组(肝脏IRI模型)、PBS处理阴性对照组(PBS处理肝脏IRI模型)、干预组(过继转移CD103+DCs预处理组、Flt3抑制剂预处理组、Flt3抑制剂与过继转移CD103+DCs共处理组和Flt3L预处理组),每组8只。常规清洁饲养,室温24℃左右,12小时明暗交替。采用无创血管夹阻断肝脏左叶和中叶的出入血管,使70%的肝脏缺血;假手术组仅分离小鼠肝动脉和门静脉,未予夹闭血管;对照组中小鼠无任何干预。干预组各组小鼠按实验方案予以预处理,除模型构建小鼠外,其余各组小鼠均予肝脏缺血6小时后处死取材,留取外周血标本采用ELISA检测肝脏功能,肝脏标本用作组织病理检测,-80℃冻存用作分子生物检测,其余肝脏标本用作流式细胞检测及分选。采用ELISA检测各组小鼠血清中肝脏功能(ALT、AST、LDH)的水平、炎症细胞因子TNF-α IL-1β、IL-6,Treg相关的细胞因子IL-10、TGF-β的含量,RT-qPCR检测ICAM-1、TNF-α、IL-1β的基因表达水平,WB检测IL-1β、ICAM-1炎症细胞因子的蛋白表达水平;HE染色观察小鼠肝脏病理损伤改变,TUNEL染色检测肝脏细胞凋亡程度;流式细胞仪检测肝脏组织中CD103+DCs和Treg细胞的数量和比例的数量、比例以及体外实验检测肝细胞凋亡比例。采用SPSS17.0统计软件包进行分析。计量资料先检验是否符合正态分布,符合者以均数±标准差(x±s)表示,两组数据之间比较采用t检验,三组及以上数据采用单向方差分析,方差齐用Bonferroni检验,方差不齐则用Tamhane检验,重复测量资料采用重复测量资料方差分析,不符合正态分布者采用非参数检验。校验水准α=0.05。采用Image J软件对免疫组化及免疫荧光结果进行统计。采用Graph pad 5.0对结果进行处理并作图。结果1.按照纳入标准及排除标准,纳入肝癌患者43例,其中男31例,女12例。TAE术后1d、2d、3d患者ALT、AST较术前明显升高,两者均在术后第2d升高最明显,LDH在术后亦明显升高,术后1d升高最为明显。TAE术后1d、2d、3d患者MDA及IL-6指标均较术前明显升高,且都在术后1d达到高峰,其后缓慢下降,但均高于术前水平(P<0.05),SOD在术后第一天明显下降(P<0.05),术后2-3d仍低于术前水平。以术后1d为例,在碘油>12ml组(n=17),肝功能ALT、AST指标、IRI指标LDH、MDA及IL-6指标明显高于<12ml组(n=26),而SOD明显低于<12ml组;2.肝脏IRI模型构建:观察给予肝脏缺血60min,再灌注Oh、6h、12h、24h各组小鼠模型的肝脏损伤显示:小鼠肝脏组织学损伤随着再灌注时间的延长逐渐升高,小鼠血清ALT、AST、LDH水平随着再灌注时间的延长逐渐升高,于再灌注12 h达到高峰,而后有所恢复。炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平在再灌注6h达到高峰,CD103+DCs在肝脏IRI模型中的变化与之呈负相关,再灌注6h后CD103+DCs 比例最低。3.给予肝脏IRI模型小鼠预先外源性回输CD103+DCs后,流式细胞仪检测肝脏组织中CD103+DCs的变化,发现肝脏组织中CD103+DCs的比例较IRI模型组明显升高,IRI组的CD103+DCs比例占总DCs的8.85%,而外源性回输组中比例为14.2%,肝脏损伤程度与IRI模型小鼠相比有明显改善,表现为过继转移CD103+DCs后:1)肝脏功能指标如:ALT、AST和LDH较模型小鼠明显降低;2)肝脏组织病理HE染色可见细胞水肿及炎性细胞浸润程度明显改善,肝脏损伤评分明显减低,TUNEL染色可见肝脏组织中细胞未见明显凋亡;3)肝脏组织凋亡相关的基因(Fas、Bax)和蛋白(Bcl-2)的表达降低。4.分别在建立肝脏缺血再灌注模型前给与Flt3抑制剂(MLN518)、CD103+DCs过继转移(DCs infusion)、MLN518 联合过继转移 CD103+DCs(MLN518+DCs infusion)和补充Flt3L处理,再灌注6小时后收集各组小鼠的肝脏组织标本。1)流式结果显示,与IRI组相比,MLN518组的肝脏组织中CD103+DCs比例显著降低,且具有统计学差异(P<0.05);Flt3L组肝脏组织中CD103+DCs比例显著升高(P<0.05);与 DCs infusion 组相比,MLN518+DCs infusion 组肝脏组织中CD103+DCs比例显著降低,且具有统计学差异(P<0.05);2)肝脏功能及组织病理结果显示:与IRI组相比,Flt3L组ALT、AST和LDH水平及肝脏损伤评分都显著降低(P<0.05),与CD103+DCs infusion组相比,MLN518+CD103+DCs infusion组ALT、AST和LDH水平及肝脏损伤评分都显著升高,且具有统计学差异(P<0.05);3)肝脏组织凋亡相关检测显示:与IRI组相比,MLN518组肝脏组织中促凋亡基因Fas和Bax的表达显著升高,抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低(p<0.05);Flt3组肝脏组织中促凋亡基因Fas和Bax的表达显著降低,抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达显著升高(p<0.05);与DCs infusion组相比,MLN518+DCs infusion组肝脏组织中促凋亡基因Fas和Bax的表达显著升高,抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低(p<0.05);4)RT-qPCR检测肝脏组织炎症因子表达显示与IRI组相比,MLN518组的肝脏组织中TNF-αIFN-γ、ICAM-1、IL-2mRNA 以及 IL-1β 蛋白表达显著增加(p<0.05);Flt3 组肝脏组织中TNF-α、IFN-γ、ICAM-1、IL-2 mRNA以及IL-lβ蛋白表达显著降低(p<0.05);与 DCs infusion 组相比,MLN518+DCs infusion 组肝脏组织中 TNF-α、IFN-γ、ICAM-1、IL-2mRNA 以及 IL-1β 蛋白表达显著增加(p<0.05)。5.在建立肝脏缺血再灌注模型前给与Flt3抑制剂(MLN518)、CD103+DCs过继转移(DC infusion)、MLN518 联合过继转移 CD103+DCs(MLN518+DCs infusion)和补充Flt3L不同处理,流式结果显示,与IRI组相比,MLN518组的外周血中Treg细胞比例显著降低,且具有统计学差异(P<0.05)。Flt3L组外周血中Treg细胞比例显著升高(P<0.05),与DCs infusion组相比,MLN518+DCs infusion组外周血和肝脏组织中Treg细胞比例显著降低,且具有统计学差异(P<0.05)。在混合淋巴细胞反应实验中将CD4+T细胞与不同条件的 CD103+DCs(阴性对照组、si-Flt3+Flt3L 组、si-RNA+Flt3L 及 Flt3L 组)共培养后,检测Treg细胞在CD4+T细胞中的比例。结果显示:与PBS对照组相比,Flt3L组Treg细胞比例显著升高(P<0.01),TGF-β和IL-10的基因表达水平显著升高;与Flt3L组相比Flt3L+si-Flt3组Treg细胞比例显著降低(P<0.01),TGF-β和IL-10的基因表达水平显著降低(P<0.01);而Flt3L组与Flt3L+si-RNA组之间无显著差异(P>0.05)。6.在缺氧复氧模型中,缺氧再给氧处理后肝细胞的凋亡率显著提高。将L02肝细胞系与不同处理后的CD103+DCs共培养(阴性对照组、si-Flt3+Flt3L组、si-RNA+Flt3L及Flt3L组),与PBS对照组相比,Flt3L组肝细胞凋亡比例显著降低(P<0.01)。与Flt3L组相比Flt3L+si-Flt3组肝细胞凋亡比例显著升高(P<0.01)。而 Flt3L 组与 Flt3L+siRNA 组之间无显著差异(P>0.05)。结论1.肝癌TAE术后,被栓塞的肿瘤组织及正常肝组织可发生IRI,IRI的程度与肝损伤的程度存在相关性;肝损伤及IRI程度与被栓塞面积呈正相关;2.过继转移CD 103+DCs可减轻肝脏IRI模型小鼠肝脏损伤和炎症状态,改善肝脏功能。3.CD103+DCs在肝脏IRI模型中的肝脏保护作用是通过调控其表面Flt3/Flt3L靶点的表达来实现的。4.CD103+DCs可促进肝脏IRI模型中Treg的分化和增殖进而减轻肝脏IRI。