【摘 要】
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目的:与传统反义试剂寡核苷酸(S-ODN)相比,新开发的肽核酸(PNA)具有诸多优点,但较低的细胞摄取率在很大程度上限制了它在分子生物学领域的应用.该文探索一种有效的方法增加PN
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目的:与传统反义试剂寡核苷酸(S-ODN)相比,新开发的肽核酸(PNA)具有诸多优点,但较低的细胞摄取率在很大程度上限制了它在分子生物学领域的应用.该文探索一种有效的方法增加PNA的细胞摄取率,继而在细胞培养抑制实验中,评价PNA通过封闭端粒酶模板(hTR)而抑制胃癌细胞SGC7901增殖的效果、比较PNA与S-ODN的抑制效果、探讨PNA对端粒酶活性表达的抑制作用机制和这种新兴的端粒酶介导抑癌途径的潜在价值.方法:PNA与相应的寡核苷酸杂交形成杂交复合物,经脂质体Lipofectamine2000包裹后,转染胃癌SGC7901细胞,测定转染率;筛选PNA的最佳作用剂量;通过细胞克隆形成抑制实验及细胞生长抑制实验来观察细胞水平抑制效果及细胞形态学变化;采用聚合酶链反应-酶联免疫反应(PCR-ELISA)和银染法在分子水平检测细胞端粒酶活性的变化;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测hTR基因及端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达;附加流式细胞术(FCM)观察细胞的凋亡情况.结果:转染前杂交并经脂质体介导的方法能够提高PNA的细胞摄取率,转染率达68.1﹪.PNA的最佳作用剂量约为100nM.第3天即可发现AP-D-L组细胞端粒酶活性明显被抑制(
P<0.05 and P<0.01),直至实验结束.第24天后AP-D-L组细胞形态发生明显改变:细胞数量减少,细胞变圆,细胞膜收缩,核浓缩于核膜,可见大量的悬浮细胞碎片.可发现AP-D-L组细胞凋亡信号峰,而对照组未见.药物作用40天后,PNA作用组(AP-D-L组)细胞克隆形成率为1.9﹪,而S-ODN作用组(S-L组)和空白对照组(B组)分别为15.8﹪和48.5﹪,AP-D-L组与后两组差异明显(P<0.05 and P<0.01).在实验过程中,始终可检测到hTR基因及hTERT基因的不同程度表达.结论:PNA对胃癌细胞SCG7901端粒酶活性的抑制呈现剂量依赖模式.hTR是抗端粒酶的有效靶点,该靶点功能的发挥独立于人类端粒酶RNA基因和人类端粒酶逆转录酶基因的表达.端粒酶介导的肿瘤抑制过程存在"滞后期",即端粒酶活性被抑制后2-3周才会出现细胞水平的抑制效果.相同碱基组成、相同作用浓度下肽核酸的反义封闭效果明显优于寡核苷酸.肽核酸的介入结合端粒酶介导的抑癌策略是非常有前景的.
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