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目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五大癌症且严重威胁我国人民的生命健康,肝癌的异质性及一小撮“干细胞”的存在导致其容易术后复发转移率。新近研究表明肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)可能参与肿瘤干细胞(cancer stem cell)的诱导与维持。肿瘤微环境重要组分肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)能诱导肿瘤细胞的“干性”,而Notch信号通路常介导肿瘤微环境与肿瘤细胞间的相互作用,我们的前期研究表明Notch信号通路能够维持CD90+肝癌干细胞的“干性”并且CAFs能够激活肝癌细胞的Notch信号通路。在肝癌中CAFs是否参与其“干性”的诱导和维持?Notch信号通路在CAFs诱导肝癌细胞“干性”中的作用如何?其确切的分子机制如何?本研究旨在深入阐明CAFs激活Notch信号通路诱导肝癌细胞“干性”的关键分子位点,可从肿瘤微环境与肿瘤干细胞这一角度为肝癌的转移复发提供新的靶向治疗策略并完善肝癌的复发转移机制。方法:我们首先从新鲜肝癌标本中提取并鉴定CAFs,建立CAFs与肝癌细胞的共培养体系,并通过NOD/SCID小鼠皮下成瘤、Transwell、平板克隆及浮球实验来检测肝癌细胞的“干性”特征,通过RT-PCR及Western blot来检测“干性”相关基因(Nanog,Sox2和Oct4)的表达差异。接着我们使用蛋白芯片及Elisa实验检测CAFs培养液中细胞因子的分泌情况,筛选出表达量最大的细胞因子IL6,并通过细胞因子调控实验检测IL6对肝癌细胞“干性”及Notch信号通路的影响。然后采用Notch1-sh RNA慢病毒载体及γ-分泌酶抑制剂(RO4929097)在基因及蛋白水平抑制MHCC-97H肝癌细胞中的Notch信号通路,检测阻断Notch信号通路后,CAFs及IL6对肝癌细胞“干性”的诱导作用。在确认CAFs分泌IL6激活Notch信号通路的基础上,使用STAT3的磷酸化抑制剂Cryptotanshinone抑制MHCC-97H肝癌细胞中STAT3的磷酸化,观察IL6对肝癌细胞“干性”及Notch信号通路的作用,解析IL6激活Notch信号通路的分子机制。最后将88对肝癌标本做成组织芯片,检测CAFs相关分子α-SMA和Notch信号通路关键分子NICD在肝癌标本中的表达并分析其与临床病理特征之间的关系。结果:(1)通过与CAFs共培养,HLE和MHCC-97H细胞的成球能力、克隆形成能力、侵袭转移能力和NOD/SCID小鼠皮下成瘤能力显著增强;western blot及q RT-PCR结果显示:CAFs上调HLE和MHCC-97H细胞干性基因(Nanog、Sox2和Oct4)及Notch信号通路关键分子(Notch1、NICD和Hes1)的表达。(2)蛋白芯片结果显示MHCC-97H细胞与CAFs共培养后,CAFs分泌量最大的细胞因子是IL6,而MHCC-97H细胞中IL6的分泌量很小。通过细胞因子调控实验,我们发现IL6能增强MHCC-97H细胞的成球能力、克隆形成能力、侵袭转移能力和NOD/SCID小鼠皮下成瘤能力。(3)CAFs与MHCC-97H细胞共培养及IL6刺激MHCC-97H细胞后,Notch信号通路关键分子(Notch1、NICD和Hes1)的表达升高,下调MHCC-97H细胞的Notch信号通路能显著抑制CAFs和IL6对MHCC-97H细胞成球能力、增殖能力、侵袭转移能力和NOD/SCID小鼠成瘤能力的促进作用;MHCC-97H细胞中Notch信号通路被抑制后,CAFs和IL6不能上调MHCC-97H细胞干性基因(Nanog、Sox2和Oct4)及Notch信号通路关键分子(Notch1、NICD和Hes1)的表达。(4)抑制Stat3的磷酸化能阻断CAFs和IL6激活MHCC-97H细胞的Notch信号通路,并抑制CAFs和IL6对MHCC-97H细胞的成球能力、增殖能力、侵袭转移能力和NOD/SCID小鼠成瘤能力的促进作用。(5)免疫组织化学(IHC)检测显示:α-SMA和Notch信号通路关键分子NICD在肝癌标本中的表达明显高于癌旁组织,NICD在肝癌组织细胞核中的表达与门静脉癌栓形成及淋巴结转移明显相关。结论:(1)CAFs能够诱导肝癌细胞的自我更新、侵袭转移及体内外成瘤等“干性”特征并上调肝癌细胞中“干性”相关基因(Nanog,Sox2和Oct4)的表达;(2)CAFs能够分泌大量的IL-6,并通过IL6诱导肝癌细胞的“干性”特征。(3)IL-6可以通过STAT3 Tyr705磷酸化激活肝癌细胞的Notch信号通路,Notch信号通路激活后肝癌细胞的“干性”特征明显增强。(4)Notch信号通路关键分子NICD可以作为潜在的预测肝癌患者预后的指标。肿瘤微环境是肿瘤细胞赖以生存的内在环境,该研究从肿瘤微环境与肿瘤干细胞这一角度完善肝癌干细胞的调控机制,可望为彻底消灭肝癌干细胞及肝癌防治提供新的思路。由于时间有限我们只研究了CAFs分泌量最大的细胞因子IL6对肝癌细胞“干性”的影响,在之后的研究中我们将探索CAFs分泌的多种细胞因子及肿瘤微环境中的多种细胞对肝癌细胞“干性”的联合作用。