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动脉粥样硬化作为心脑血管疾病的病理学基础,已成为导致人类死亡的主要原因。由氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,oxLDL)驱动的巨噬细胞泡沫化在动脉粥样硬化发病机制中发挥了关键作用。研究显示,清道夫受体CD36及血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)密切参与并调控了巨噬细胞泡沫化的形成,因此研究二者与oxLDL的相互作用关系,并阐明该作用对胆固醇转运过程的调控机制,对预防和治疗动脉粥样硬化具有重要的意义。在前期研究中,从oxLDL脂类提取物中分离得到一种新型表位结构—7-酮基胆甾醇壬二酸单酯(7-ketocholesterylcarboxynonanoate,oxLig-1),并推测 oxLig-1很可能介导了 oxLDL与清道夫受体CD36、LOX-1的结合作用,从而调控了巨噬细胞对oxLDL的摄取及转运过程。为了进一步明确oxLDL诱导巨噬细胞泡沫化形成的作用机制,本论文以oxLig-1、CD36及LOX-1为研究对象,主要从以下几个方面展开了研究。首先通过分子对接模拟、酶联免疫分析(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)以及表面等离子体共振技术(Surface plasmon resonance,SPR)分别对oxLig-1与CD36、LOX-1的结合作用加以研究,结果发现oxLig-1作为表位结构介导了 oxLDL与清道夫受体CD36、LOX-1的结合作用,并且该结合作用表现出高度的结合亲和性。随后分别对oxLig-1的各亚结构组份以及甲基化修饰物进行分析后发现,oxLig-1的疏水核心结构为结合作用提供了疏水作用,而ω-COOH则是结合过程中的主要位点,为结合构象的稳定和结合作用的加固发挥了关键作用。其次借助慢病毒介导的基因沉默技术分别构建得到CD36及LOX-1稳转基因沉默巨噬细胞株,并以此为模型在细胞水平验证了 oxLig-1与CD36、LOX-1的结合作用。随后利用基因沉默细胞模型以及激光共聚焦技术分析了 CD36介导oxLDL吞噬的具体机制。结果显示,oxLig-1可在细胞膜表面同CD36以及Caveolin-1发生共定位,同时oxLig-1及oxLDL的刺激作用可诱导Caveolin-1发生膜向移位以及聚集。与之相比oxLig-1的甲基化修饰物(me-oxLig-1)未表现出此作用。进一步研究发现,Caveolin-1构成的脂筏结构密切参与了巨噬细胞吞噬摄取oxLDL的过程,而CD36及Caveolin-1的基因沉默均大幅减少了胆固醇在细胞中的积累,表明CD36在与oxLDL表位结构oxLig-1结合后,能够启动Caveolin-1脂筏的形成,并通过此方式介导了 oxLDL的吞噬和摄取作用。再次研究了 oxLig-1与CD36的结合作用对Caveolin-1蛋白表达的影响及相关调控机制。免疫共沉淀、基因沉默及抑制剂干预实验结果显示,oxLig-1与CD36结合作用在启动脂筏形成以及oxLDL吞噬摄取作用的同时,能够激活CD36下游Src-JNK/ERK信号传导通路,导致核转录因子NF-κB被活化,进而上调了 Caveolin-1的蛋白表达,最终进一步加速了 Caveolin-1脂筏的形成以及oxLDL的吞噬摄取作用。最后评价了 LOX-1在巨噬细胞胆固醇转运过程中的作用。结果发现,LOX-1基因沉默明显增强了巨噬细胞胆固醇蓄积作用。Western blot实验结果显示,oxLDL以及oxLig-1的刺激作用可通过浓度和作用时间依赖的方式上调ABCA1(ATP binding cassette transporter A1)的蛋白表达,而oxLig-1的甲基化修饰和LOX-1蛋白表达缺失均能够抑制此上调作用。进一步的报告基因及抑制剂干预实验结果表明,oxLDL在启动巨噬细胞泡沫化的同时,还可通过其表位配体oxLig-1与LOX-1的结合作用诱导核转录因子 PPARy(Peroxisome proliferator activated receptorγ)发生活化,进而启动PPARγ-LXRα-ABCA1信号传导通路,上调ABCA1的蛋白表达,最终促进了胆固醇逆转运作用,避免胆固醇在细胞中过度蓄积。本论文阐明了 oxLDL与CD36及LOX-1的相互作用关系,并明确了该结合作用在巨噬细胞胆固醇转运过程中的调控机制,为今后以此为靶点开发治疗动脉粥样硬化的相关药物奠定了基础。