研究背景胶质瘤(Glioma)是成年人中枢神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤,其中,脑胶质瘤能够占到所有颅内原发性肿瘤的百分之七十左右,而半数以上的脑胶质瘤为恶性程度最高的胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)。近年来,虽然针对胶质瘤的外科手术治疗、放疗与化疗、基因与免疫治疗等均有重大发展,但在临床实践中仍未能取得令人满意的效果,胶质瘤依然是治愈率低、复发率高、预后差的中枢神经系统肿瘤。胶质瘤发生发展过程中会逐步形成免疫抑制性肿瘤微环境,且胶质瘤具有浸润性生长的特点,这些是导致胶质瘤治疗效果不佳的主要原因。因此,对胶质瘤免疫抑制性微环境及胶质瘤恶性表型的深入研究,将有助于揭示胶质瘤恶性进展的机制,从而完善胶质瘤的综合治疗策略,提升胶质瘤的治疗效果。肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TME)是肿瘤发生发展过程中逐步形成的由物理组分、生化组分及细胞组分构成的复杂微环境,其在促进肿瘤恶性进展、抵抗化疗药物、免疫抑制等方面均有重要作用。由于实体肿瘤早期增殖迅速,氧气消耗过多,且肿瘤内部血管结构及功能异常,导致低氧成为实体肿瘤微环境标志性的特征之一。胶质瘤作为典型的实体肿瘤,其微环境中亦存在广泛的低氧区域。低氧不但能够调控胶质瘤的生物学行为,导致其代谢方式改变、增殖及侵袭能力增强,还可以促进胶质瘤免疫抑制性微环境的形成。因此,阐明低氧对胶质瘤恶性生物学行为及胶质瘤免疫抑制性微环境形成的作用及机制,有助于寻找新的靶点,抑制胶质瘤恶性进展,改善患者预后。作为肿瘤微环境的重要组分,外泌体(Exosome)在肿瘤发生发展中发挥关键作用。外泌体是一类直径在30～100纳米的囊泡状结构,可以由多种类型的细胞分泌,含有蛋白质、核酸等成分,能够参与细胞间的物质交换和信息传递。在肿瘤微环境中,外泌体可以直接作用于肿瘤细胞,促进其发生发展;也可以靶向浸润肿瘤微环境的免疫细胞,诱导免疫抑制性肿瘤微环境的形成。更重要的是,低氧能够改变外泌体的分泌特征,影响外泌体对靶细胞的调节作用。因此,探究低氧如何通过外泌体影响胶质瘤恶性表型及胶质瘤免疫抑制性微环境的形成,有利于明确胶质瘤恶性进展的调控机制,为丰富胶质瘤治疗策略提供新的依据。肿瘤微环境中浸润的免疫抑制性细胞是形成免疫抑制性肿瘤微环境的关键因素,这些免疫抑制性细胞包括肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophage,TAM)、骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cell,MDSC)、调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)以及调节性树突状细胞(Regulatorydendritic cell,regDC)等,其中,肿瘤相关巨噬细胞是胶质瘤微环境中最主要的免疫抑制性细胞。巨噬细胞存在两种极化类型,即具有免疫促进功能的M1型(经典活化型)和具有免疫抑制功能的M2型(选择活化型)。肿瘤相关巨噬细胞具有M2型巨噬细胞的特征,其通过参与免疫抑制性肿瘤微环境形成促进肿瘤的恶性进展。低氧能够通过诱导巨噬细胞M2型极化促进免疫抑制性肿瘤微环境形成,但肿瘤外泌体是否参与此过程尚不清楚。因此,阐明胶质瘤外泌体在低氧诱导的肿瘤相关巨噬细胞M2型极化中的作用机制,能够发现调控免疫抑制性肿瘤微环境的重要靶点,为抑制胶质瘤恶性进展、抗胶质瘤免疫治疗提供新的证据。除了免疫抑制性肿瘤微环境,胶质瘤的恶性表型也是导致其治疗效果不理想的重要原因,其中,侵袭和迁移是胶质瘤最主要的恶性生物学行为之一。胶质瘤在脑内呈弥漫浸润性生长,因此,手术难以完全切除,残余胶质瘤细胞可继续增殖、侵袭和迁移,导致胶质瘤难治愈、易复发。肿瘤的侵袭和迁移涉及细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)降解、细胞骨架变化、上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)等过程,有基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)家族成员、Rho家族蛋白等参与,并受到PI3K、MAPK等信号通路调控。低氧能够增强MMP的表达和分泌、影响细胞骨架变化、促进EMT发生,进而促进胶质瘤的侵袭和迁移,但是,胶质瘤外泌体是否参与上述过程尚不明确。因此,阐明低氧胶质瘤外泌体对胶质瘤侵袭和迁移的作用机制,有利于发现胶质瘤治疗的新靶点,为抑制胶质瘤的侵袭和迁移提供新的理论。此外,Rho家族蛋白RhoA、Racl以及Cdc42是影响胶质瘤侵袭和迁移的关键分子,而鸟苷酸交换因子(Guaninenucleotideexchangefactor,GEF)是Rho家族蛋白最重要的活性调控分子。PLEKHG5(Pleckstrin homology and RhoGEF domain containing G5)是GEF家族成员之一,能够调节Rho家族蛋白的活性,参与细胞迁移、细胞自噬、血管新生等过程。但是,PLEKHG5在胶质瘤中是否表达,其对胶质瘤的具体作用尚不清楚。因此,探究PLEKHG5在胶质瘤中的表达情况及其对胶质瘤的具体作用,可能为抑制胶质瘤恶性进展发现新的靶点,改善胶质瘤患者的预后。本文主要从胶质瘤免疫抑制性微环境及胶质瘤恶性表型两方面进行研究,分别阐明了低氧胶质瘤外泌体对巨噬细胞M2型极化的作用机制、低氧胶质瘤外泌体对胶质瘤侵袭迁移的作用机制和PLEKHG5在胶质瘤侵袭迁移中的作用。首先,我们揭示了胶质瘤外泌体在低氧诱导的巨噬细胞M2型极化中发挥重要作用;其次,我们发现了低氧胶质瘤外泌体在胶质瘤侵袭和迁移中的关键作用;最后,我们明确了 PLEKHG5在胶质瘤中的表达情况,并证明PLEKHG5对胶质瘤侵袭和迁移的调控作用。综上所述,本文对胶质瘤免疫抑制性微环境及胶质瘤恶性生物学行为进行了相关基础研究,为揭示胶质瘤恶性进展的机制提供了新的依据,为完善胶质瘤的综合治疗策略提供了新的靶点,有助于提升胶质瘤的临床治疗效果,有着重要的学术意义和广泛的应用前景。第一部分低氧胶质瘤外泌体对巨噬细胞M2型极化的作用机制研究1.目的(1)探究低氧胶质瘤外泌体对巨噬细胞M2型极化的作用。(2)基于外泌体microRNA测序分析,筛选出低氧胶质瘤外泌体中富集的可能与巨噬细胞M2型极化相关的microRNA(microRNA-1246)。(3)阐明microRNA-1246对巨噬细胞M2型极化的具体作用机制。(4)揭示microRNA-1246在胶质瘤患者脑脊液中的表达情况,明确microRNA-1246在胶质瘤中的临床相关性。2.方法(1)外泌体的分离与鉴定通过超速离心法和沉淀法提取胶质瘤外泌体。应用透射电镜、粒径分析、Western blot对提取的外泌体进行鉴定。(2)巨噬细胞M2型极化的检测对巨噬细胞M2型极化的检测包括以下几种方法:①PCR检测巨噬细胞M2型极化相关分子(CD163、IL10、IL1RA等)的表达。②流式细胞术检测巨噬细胞表面CD163的表达。③ELISA检测巨噬细胞IL-10、TNF-α的分泌。(3)胶质瘤细胞增殖能力的检测胶质瘤细胞与不同处理的巨噬细胞共培养后,EdU实验检测胶质瘤细胞的增殖能力。(4)胶质瘤侵袭和迁移能力的检测胶质瘤细胞与不同处理的巨噬细胞共培养后,Transwell实验检测胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。(5)胶质瘤外泌体的microRNA测序分别提取常氧、低氧胶质瘤的外泌体,并对外泌体中microRNA进行测序,获得常氧、低氧胶质瘤外泌体的microRNA表达谱数据。(6)胶质瘤患者脑脊液的microRNA测序收集胶质瘤患者脑脊液,并对脑脊液中microRNA进行测序,获得胶质瘤患者脑脊液的microRNA表达谱数据。(7)MicroRNA、mRNA和蛋白水平的检测对外泌体中microRNA和细胞内microRNA、mRNA、蛋白的表达检测,分别进行相应特定处理提取总RNA或总蛋白,PCR和Western blot检测microRNA、mRNA、蛋白的表达水平。(8)细胞转染及稳定表达microRNA-1246的单核细胞系的构建MicroRNA-1246 mimic、microRNA-1246 inhibitor、TERF2IP siRNAs、TERF2IP过表达质粒、TERF2IP 的 3’非翻译区(Untranslatedregion,UTR)含有 microRNA-1246野生型或突变型互补结合序列的双荧光素酶报告基因质粒,利用Lipo3000进行转染,用于过表达或者敲除相应目的分子,进而研究相应表型变化。稳定表达microRNA-1246的慢病毒转染U937细胞系以构建稳定表达microRNA-1246的单核细胞系。(9)巨噬细胞的mRNA测序将对照细胞与过表达microRNA-1246的巨噬细胞进行mRNA测序,获得对照、过表达microRNA-1246的巨噬细胞的mRNA表达谱数据。(10)裸鼠颅内原位人脑GBM细胞成瘤实验利用荧光素酶标记的U87MG胶质瘤细胞系建立裸鼠颅内原位成瘤模型。将荧光素酶标记的U87MG细胞与不同处理的巨噬细胞共同原位注射于裸鼠脑内,通过小动物活体成像系统监测颅内肿瘤状况,观察记录裸鼠症状体征,裸鼠死后取其脑组织进行后续研究和分析。3.结果(1)低氧胶质瘤外泌体诱导巨噬细胞M2型极化PCR、流式细胞术及ELISA结果显示,低氧胶质瘤外泌体能够诱导巨噬细胞M2型极化。并且,EdU、Transwell实验显示低氧胶质瘤外泌体处理的巨噬细胞增强胶质瘤的增殖、侵袭和迁移。裸鼠颅内原位成瘤实验显示,低氧胶质瘤外泌体处理的巨噬细胞会促进胶质瘤的增殖和侵袭,使裸鼠生存期缩短。(2)MicroRNA-1246在低氧胶质瘤外泌体及胶质瘤患者脑脊液中富集胶质瘤外泌体microRNA测序结果显示,microRNA-1246在低氧胶质瘤外泌体中表达上调且含量最高。PCR结果显示低氧上调胶质瘤外泌体中microRNA-1246的表达,并且胶质瘤外泌体中的microRNA-1246能够被传递给巨噬细胞。胶质瘤患者脑脊液microRNA测序结果显示,microRNA-1246的表达与胶质瘤患者的肿瘤级别和手术状态密切相关。(3)MicroRNA-1246诱导巨噬细胞M2型极化PCR、流式细胞术及ELISA结果显示,microRNA-1246能够诱导巨噬细胞M2型极化。并且,EdU、Transwell实验显示过表达microRNA-1246的巨噬细胞增强胶质瘤的增殖、侵袭和迁移。裸鼠颅内原位成瘤实验显示,过表达microRNA-1246 的巨噬细胞会促进胶质瘤的增殖和侵袭,使裸鼠生存期缩短。(4)TERF2IP是低氧胶质瘤外泌体中microRNA-1246诱导巨噬细胞M2型极化的直接靶基因巨噬细胞mRNA测序结果显示,TERF2IP的表达受microRNA-1246调控。PCR、Western blot结果显示低氧胶质瘤外泌体及microRNA-1246下调TERF2IP的表达。荧光素酶报告基因实验显示,microRNA-1246能够与TERF2IP的3’UTR的互补序列结合。PCR、流式细胞术及ELISA结果显示,敲除TERF2IP能够诱导巨噬细胞M2型极化。并且,EdU、Transwell实验显示敲除TERF2IP的巨噬细胞增强胶质瘤的增殖、侵袭和迁移。此外,过表达TERF2IP能够减弱microRNA-1246 对巨噬细胞 M2 型极化的诱导作用。(5)低氧胶质瘤外泌体来源的microRNA-1246通过调控STAT3及NF-κB信号通路诱导巨噬细胞的M2型极化Western blot结果显示低氧胶质瘤外泌体能够引起巨噬细胞内STAT3及NF-κB信号通路相关蛋白表达的变化。同样地,Western blot结果显示microRNA-1246及TERF2IP也能导致巨噬细胞内STAT3及NF-κB信号通路相关蛋白表达的改变。4.结论(1)低氧胶质瘤外泌体中的microRNA-1246通过靶向TERF2IP调控STAT3及NF-κB信号通路进而诱导巨噬细胞的M2型极化。(2)MicroRNA-1246在胶质瘤患者脑脊液中富集,在胶质瘤患者中存在临床相关性,可以作为胶质瘤诊断和治疗的靶点。第二部分低氧胶质瘤外泌体对常氧胶质瘤细胞侵袭和迁移的作用机制研究1.目的(1)探究低氧胶质瘤外泌体对常氧胶质瘤细胞侵袭和迁移的作用。(2)基于外泌体microRNA测序分析,筛选出低氧胶质瘤外泌体中富集的可能与胶质瘤侵袭和迁移相关的microRNA(microRNA-1246和microRNA-10b-5p)。(3)阐明microRNA-1246、microRNA-1 0b-5p对胶质瘤侵袭和迁移的具体作用机制。(4)明确microRNA-1246、microRNA-10b-5p在胶质瘤中的临床相关性。2.方法(1)外泌体的分离与鉴定通过超速离心法和沉淀法提取胶质瘤外泌体。应用透射电镜、粒径分析、Western blot对提取的外泌体进行鉴定。(2)胶质瘤侵袭和迁移能力的检测对胶质瘤侵袭和迁移能力的检测包括以下几种方法:①Transwell实验检测胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。②3D肿瘤球侵袭实验检测胶质瘤细胞的侵袭能力。(3)胶质瘤外泌体的microRNA测序分别提取常氧、低氧胶质瘤的外泌体,并对外泌体中microRNA进行测序,获得常氧、低氧胶质瘤外泌体的microRNA表达谱数据。(4)MicroRNA、mRNA和蛋白水平的检测对外泌体中microRNA和细胞内microRNA、mRNA、蛋白的表达检测,分别进行相应特定处理提取总RNA或总蛋白,PCR和Western blot检测microRNA、mRNA、蛋白的表达水平。(5)细胞转染及稳定表达microRNA-1246和microRNA-10b-5p的胶质瘤细胞系的构建MicroRNA-1246 mimic、microRNA-10b-5p mimic、FRK siRNAs、TFAP2A siRNAs、FRK过表达质粒、TFAP2A过表达质粒、FRK的3’非翻译区(Untranslated region,UTR)含有microRNA-1246野生型或突变型互补结合序列的双荧光素酶报告基因质粒,TFAP2A 的 3’非翻译区(Untranslatedregion,UTR)含有microRNA-10b-5p野生型或突变型互补结合序列的双荧光素酶报告基因质粒,利用Lipo3000进行转染,用于过表达或者敲除相应目的分子,进而研究相应表型变化。稳定表达microRNA-1246和microRNA-10b-5p的慢病毒分别转染胶质瘤细胞系以构建稳定表达microRNA-1246和microRNA-10b-5p的胶质瘤细胞系。(6)裸鼠颅内原位人脑GBM细胞成瘤实验利用荧光素酶标记的U87MG胶质瘤细胞系建立裸鼠颅内原位成瘤模型。将不同处理的荧光素酶标记的U87MG细胞原位注射于裸鼠脑内,通过小动物活体成像系统监测颅内肿瘤状况,观察记录裸鼠症状体征,裸鼠死后取其脑组织进行后续研究和分析。3.结果(1)低氧胶质瘤外泌体促进常氧胶质瘤细胞的侵袭和迁移Transwell及3D肿瘤球侵袭实验结果显示,低氧胶质瘤外泌体能够促进常氧胶质瘤细胞的侵袭和迁移。并且,Western blot结果显示低氧胶质瘤外泌体能够增强常氧胶质瘤细胞中MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin等蛋白的表达。裸鼠颅内原位成瘤实验显示,低氧胶质瘤外泌体会促进胶质瘤的侵袭和迁移,使裸鼠生存期缩短。(2)MicroRNA-1246与microRNA-l0b-5p在低氧胶质瘤外泌体中富集且存在临床相关性PCR结果显示低氧上调胶质瘤外泌体中microRNA-1246和microRNA-10b-5p的表达,并且低氧胶质瘤外泌体中的microRNA-1246和microRNA-10b-5p能够被传递给常氧胶质瘤细胞。生物信息学分析结果显示microRNA-1246与microRNA-10b-5p与胶质瘤患者的肿瘤级别和预后相关。(3)MicroRNA-1246、microRNA-10b-5p促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移Transwell及3D肿瘤球侵袭实验结果显示,microRNA-1246与microRNA-10b-5p能够促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。并且,Western blot结果显示microRNA-1246 与 microRNA-10b-5p 能够增强胶质瘤细胞中 MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin等蛋白的表达。裸鼠颅内原位成瘤实验显示,microRNA-1246与microRNA-10b-5p会促进胶质瘤的侵袭和迁移,使裸鼠生存期缩短。(4)FRK 与 TFAP2A 分别是 microRNA-1246 和 microRNA-10b-5p 促进胶质瘤细胞侵袭和迁移的直接靶基因Western blot 结果显示 microRNA-1246 下调 FRK 的表达,microRNA-10b-5p下调TFAP2A的表达。荧光素酶报告基因实验显示,microRNA-1246能够与FRK的3’UTR的互补序列结合,microRNA-10b-5p能够与TFAP2A的3’UTR的互补序列结合。Transwell实验结果显示,敲除FRK和TFAP2A能够促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。并且,过表达FRK能够减弱microRNA-1246对胶质瘤细胞侵袭和迁移的作用,过表达TFAP2A能够减弱microRNA-10b-5p对胶质瘤细胞侵袭和迁移的作用。4.结论(1)低氧胶质瘤外泌体通过向常氧胶质瘤细胞传递microRNA-1246和microRNA-10b-5p,进而靶向FRK和TFAP2A,最终促进常氧胶质瘤细胞的侵袭和迁移。(2)MicroRNA-1246与microRNA-10b-5p在胶质瘤患者中存在临床相关性,可以作为抑制胶质瘤侵袭和迁移的治疗靶点。第三部分:PLEKHG5在胶质瘤中的作用研究1.目的(1)探究PLEKHG5在胶质瘤中的表达情况。(2)明确PLEKHG5在胶质瘤患者中的临床相关性。(3)揭示PLEKHG5对胶质瘤的作用。2.方法(1)临床组织标本免疫组化染色临床收集不同级别的61例胶质瘤组织以及6份正常脑组织,制作石蜡切片并利用免疫组织化学染色检测正常脑组织及不同级别胶质瘤组织中PLEKHG5的表达情况。(2)生物信息学分析利用TCGA数据库中的胶质瘤数据,针对PLEKHG5进行相应的GO、KEGG及GSEA分析,探究PLEKHG5参与的生物学过程及调控的信号通路。(3)细胞转染将PLEKHG5 siRNA利用Lipo3000转染胶质瘤细胞,用于敲除PLEKHG5,进而研究相应表型变化。(4)胶质瘤细胞迁移能力的检测Transwell实验检测不同处理的胶质瘤细胞的迁移能力。(5)蛋白水平的检测对细胞内蛋白的表达检测,进行特定处理提取细胞总蛋白,Western blot检测蛋白的表达水平。3.结果(1)PLEKHG5的表达与胶质瘤级别相关免疫组化染色结果显示,相比正常脑组织,胶质瘤组织中PLEKHG5的表达更高,且PLEKHG5表达与胶质瘤级别相关。对免疫组化染色结果进一步分析发现,在胶质瘤组织中,PLEKHG5的阳性比例和表达强度均与胶质瘤级别相关。(2)PLEKHG5的表达与胶质瘤患者预后相关对纳入研究的胶质瘤患者进行随访和生存分析,结果显示PLEKHG5的表达与胶质瘤患者预后相关,PLEKHG5高表达的胶质瘤患者预后较差。(3)生物信息学分析揭示PLEKHG5在胶质瘤中的作用针对PLEKHG5进行相应GO、KEGG、GSEA分析,结果显示PLEKHG5参与胶质瘤的细胞外基质降解、细胞骨架调控、上皮-间充质转化等过程,并调控VEGF、PI3K以及HIF-1等信号通路。(4)PLEKHG5影响胶质瘤细胞的侵袭和迁移Transwell实验显示,敲除PLEKHG5能够抑制胶质瘤细胞的迁移。Western blot结果显示,敲除PLEKHG5能够下调MMP2、MMP9、mDia等胶质瘤侵袭迁移相关蛋白的表达。4.结论(1)PLEKHG5的表达与胶质瘤级别和胶质瘤患者预后相关,PLEKHG5可以作为协助胶质瘤诊断和评估胶质瘤患者预后的重要指标。(2)PLEKHG5能够促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移,可以作为抗胶质瘤侵袭和迁移治疗的新靶点。