人多能干细胞(Human pluripotent stem cells，hPSCs)，包括人胚胎干细胞(Humanembryonic stem cells，hESCs)和人诱导多能干细胞(Human induced pluripotent stemcells，hiPSCs)，在临床医学上具有极大的应用潜力。然而解离和冷冻保存会导致大量hPSCs凋亡，细胞恢复率极低，这严重阻碍了其未来临床应用。因此，本论文以hESCs为主要研究对象，检测了在解离和冻存保存后hESCs的差异蛋白质组学，分别考察了蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)抑制剂H89对解离和冷冻保存后hESCs凋亡的抑制作用，揭示了解离和冷冻保存过程中的细胞凋亡信号通路及H89抑制解离和冷冻保存后hESCs凋亡的机制，进而设计了新型hPSCs解离液、冻存液和复苏液，显著提高了解离和冷冻保存后hPSCs的恢复率。　　首先，利用iTRAQ(Isobaric tag for relative and absolute quantitation)技术检测了解离和冷冻保存后hESCs中蛋白质组的变化，分别得到132和995个差异蛋白。通过Gene Ontology(GO)分类注释、KEGG通路分析和蛋白相互作用网络构建，获取了蛋白的功能、参与的信号通路以及蛋白间的相互作用关系等信息。　　第二，在差异蛋白质组学的基础上，发现PKA抑制剂H89能够有效提高解离的hESCs在有饲养层和无饲养层培养方式下的成活率和克隆形成率。研究结果表明，H89能够降低解离诱导的ROCK底物的磷酸化水平上升，从而抑制细胞鼓泡，同时能够降低PKA及其磷酸化水平。另外，H89通过抑制解离诱导的Caspase3/7活性的增加从而减少细胞凋亡。　　第三，进一步分析了解离诱导的hESCs凋亡机理和H89在凋亡过程中的作用机制。解离诱导的hESCs凋亡涉及线粒体和死亡受体两条凋亡途径。在线粒体凋亡途径中，解离导致线粒体促凋亡蛋白及其下游凋亡执行蛋白表达水平的上调、线粒体膜电势下降和Cytc释放增多。在死亡受体凋亡途径中，解离引起了死亡受体蛋白表达水平上调，进而激活了Caspase8介导的促凋亡蛋白Bid的剪切。在解离诱导的凋亡过程中，PKA能够与p53互作并在Ser15发生磷酸化，继而磷酸化p53与Bax互作，Bax又与Bak互作，并且发现剪切的Bid(tBid)能够与线粒体促凋亡蛋白Bim相互作用。因而确定了PKA-p53/p-p53(Ser15)-Bax-Bak信号通路及tBid-Bim互作关系在解离诱导的hESCs凋亡中的作用。　　第四，考察了H89在hESCs冷冻保存过程中的作用。在无饲养层培养方式下，解离前的H89预处理和在冻存液中添加H89都可以明显提高冷冻保存后hESCs的恢复率。另外，无论是在有饲养层还是无饲养层培养方式下，在复苏液中添加H89均可显著提高冷冻保存后hESCs的恢复率。　　第五，进一步分析了冷冻保存过程中hESCs的凋亡机理。冷冻复苏诱导了PKA及ROCK底物磷酸化水平升高、线粒体促凋亡蛋白（如Bim和Bad）及下游凋亡执行蛋白和Caspase8的表达水平上调。另外，冷冻复苏导致了hESCs中E-cadherin的表达逐渐下调，而细胞骨架相关蛋白Cofilin、Filamin1和Vimentin的表达逐渐上升。　　在上述研究结果基础上，本文开发出了新型hPSCs解离液、冻存液和复苏液。这些解离液、冻存液和复苏液既能够显著提高解离和冷冻保存后hESCs的恢复率，又不影响hESCs的多能性、基因组稳定性和分化潜能，且同样适用于hiPSCs。解离和冷冻保存新策略的建立大大降低了hPSCs的操作难度，有利于hPSCs在基础研究和临床研究中的广泛应用。