背景和目的胃癌（Gastric cancer,GC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一。据2020年全球癌症统计结果显示,胃癌的发病率在全球范围内排名第五,死亡率排第四。在中国范围内,胃癌发病率排名第二,死亡率排第三。胃癌作为一种发病率高、死亡率高的肿瘤,其常规治疗方式主要包括手术和放化疗等。胃癌具有很高的侵袭性和复发性,其治疗效果欠佳,患者的5年生存率较低。鉴于胃癌的发病机制复杂、耐药率高导致其治疗失败,寻找新的胃癌防治靶点,以及针对新靶点开发新的防治药物可能为提高疗效及改善患者预后提供新的策略。真核起始因子4A-I（Eukaryotic initiation factor 4A-I,eIF4A1）是一种RNA解旋酶,是eIF4A的主要功能结构。eIF4A1作为eIF4F复合物的主要构成亚基参与帽结构的识别,水解mRNA 5’-UTR中阻止翻译起始的二级结构（茎环结构）从而允许翻译起始。许多研究表明翻译失调直接控制致癌mRNA的选择性翻译和蛋白质合成,也是肿瘤发生和进展的重要调控因素。近年来,已证实eIF4A1是促进胆囊癌、乳腺癌和胰腺癌等发生发展的关键因子。由于eIF4A1在翻译起始和致癌过程中的重要作用,该蛋白有望成为肿瘤治疗的新靶点。目前,eIF4A1在胃癌发生发展中的作用机制尚不清楚,靶向eIF4A1的抑制剂也尚未应用于肿瘤的预防与治疗。针对靶点开发新的癌症防治药物往往需要很长的研发周期,而筛选已批准上市的药物,研究其抗肿瘤特性并用于肿瘤的防治,则会大大缩短这一过程。达塞布韦是已获批上市并用于治疗丙型肝炎的抗病毒药物,是一种NS5B聚合酶（非核苷）的抑制剂。它通过与酶活性位点外NS5B结合,诱导酶的构象变化,从而阻止新生病毒基因组的进一步延伸。目前,并无达塞布韦抗肿瘤的相关报道。本研究表明,eIF4A1在胃癌组织中高表达,并与患者预后不良正相关;eIF4A1通过促进线粒体电子传递链相关功能蛋白的翻译促进胃癌的发生发展;达塞布韦可以作为一种新型的eIF4A1抑制剂,能够在体内和体外抑制胃癌生长,这为开发新的胃癌防治手段奠定了基础。方法1.EIF4A1在胃癌组织中的表达情况及与患者预后相关性分析的研究方法利用免疫组织化学染色检测eIF4A1在胃癌组织芯片中的表达情况,并分析其表达和患者预后的相关性;通过生物信息学及数据库分析eIF4A1在胃癌及癌旁组织中的mRNA表达水平与胃癌分级和患者预后的关系。2.EIF4A1对胃癌细胞体内外增殖影响的研究方法利用Western blot检测eIF4A1蛋白在不同胃癌细胞系中表达的水平,对eIF4A1高表达的HGC27和AGS细胞系使用CRISPR-Cas9系统构建eIF4A1敲除的稳转细胞系;通过细胞增殖实验评价敲除eIF4A1后,对HGC27和AGS细胞增殖能力的影响;通过平板克隆实验和软琼脂克隆形成实验评价敲除eIF4A1后对HGC27和AGS细胞锚定和非锚定依赖性生长的影响;通过构建eIF4A1敲除后的人源胃癌细胞系异种移植（Cell-derived xenograft,CDX）模型,以评价eIF4A1在体内对胃癌生长的影响。3.筛选并验证eIF4A1抑制剂的研究方法通过计算机分子模拟对临床用药进行筛选,并预测药物与eIF4A1的结合方式及可能的结合位点;分别通过纯蛋白和细胞全蛋白下拉实验,验证药物能否与eIF4A1的离体蛋白结合;通过细胞热位移实验（Cellular Thermal Shift Assay,CETSA）验证药物能否在完整细胞内与eIF4A1蛋白结合;通过蛋白质合成检测实验,评价药物处理后对细胞翻译水平的影响。4.检测达塞布韦对胃癌细胞生长影响的研究方法通过细胞增殖实验,评价达塞布韦对HGC27和AGS细胞增殖能力的影响;通过平板克隆实验和软琼脂克隆形成实验探讨达塞布韦对胃癌细胞HGC27和AGS细胞锚定和非锚定依赖性生长的作用。5.达塞布韦靶向eIF4A1抑制胃癌机制的研究方法通过分析Proteome Xchange数据库中达塞布韦处理肿瘤细胞后的蛋白质组学数据,富集到达塞布韦处理后肿瘤细胞发生改变的信号通路。利用胃癌细胞系加药处理结合eIF4A1敲除进行双向验证,通过Western blot分别验证达塞布韦处理和eIF4A1敲除后氧化磷酸化通路相关分子蛋白质水平的改变;通过qPCR验证相关分子的mRNA水平改变;检测达塞布韦处理和eIF4A1敲除后线粒体膜电位的改变;检测达塞布韦加药和eIF4A1敲除后活性氧的变化情况;通过蛋白质合成检测实验来评价eIF4A1敲除后对细胞翻译水平的影响。6.评价达塞布韦在体内抑制胃癌生长的研究方法通过建立胃癌的人源性组织异种移植（Patient-derived xenograft,PDX）模型评价达塞布韦在体内对胃癌的作用（包括瘤体积、瘤重和抑瘤率）;利用免疫组织化学染色检测达塞布韦给药后瘤组织的Ki67水平;通过Western blot检测给药处理后瘤组织中相关蛋白的表达水平。7.比较达塞布韦与CR-1-31-B在体内对胃癌抑制作用的研究方法选用目前研究较明确且被实验室广泛应用的eIF4A1抑制剂（CR-1-31-B,CR-31）与本研究所筛选出的达塞布韦对胃癌PDX小鼠做同时给药处理以进行疗效对比,测量给药处理后的瘤体积和瘤重并且计算抑瘤率,对比不同组小鼠体重变化百分比;利用免疫组织化学染色检测两种药物处理后瘤组织中的Ki67水平;通过Western blot检测两种药物处理后瘤组织中相关蛋白的表达水平;通过苏木素-伊红染色法（Hematoxylin-eosin,H＆E）检测并对比两种药物对小鼠心、肝、脾、肺和肾的毒性作用。结果1.EIF4A1在胃癌组织中高表达并与患者预后负相关组织芯片结果表明胃癌组织中eIF4A1高表达的患者生存率更低;数据库分析表明,与癌旁组织相比,胃癌组的eIF4A1 mRNA水平较高,并且其高表达组患者预后差。2.敲除eIF4A1在体内外抑制胃癌细胞的生长敲除eIF4A1抑制胃癌细胞的生长、锚定依赖性生长和非锚定依赖性生长,并且抑制胃癌CDX肿瘤的生长。3.达塞布韦靶向eIF4A1并抑制其翻译活性达塞布韦在体外与eIF4A1纯蛋白和胃癌细胞全蛋白裂解液中的eIF4A1靶向结合;细胞热位移实验进一步证实达塞布韦能够在细胞内与eIF4A1靶向结合;同时,蛋白质合成实验证实达塞布韦能够抑制胃癌细胞相关蛋白质的翻译。4.达塞布韦在体外抑制胃癌细胞生长达塞布韦在体外抑制胃癌细胞增殖、锚定依赖性生长和非锚定依赖性生长。5.达塞布韦通过靶向eIF4A1抑制电子传递链负调控线粒体氧化磷酸化达塞布韦通过靶向eIF4A1抑制线粒体电子传递链中的相关功能蛋白（NDUFA1,ATP5D和COX6B1）的翻译导致线粒体电子传递链受损、氧化磷酸化通路受抑制以及细胞活性氧产生增多进而抑制胃癌细胞的增殖。6.达塞布韦在体内抑制胃癌的生长达塞布韦在体内抑制人源性胃癌肿瘤的生长、降低瘤组织中增殖标志物Ki67的水平,并且达塞布韦处理组瘤组织中线粒体电子传递链相关蛋白（NDUFA1,ATP5D,COX6B1）较对照组更低。7.达塞布韦与CR-31在体内对胃癌生长具有相同的抑制作用达塞布韦与CR-31均可在体内抑制人源性胃癌肿瘤的生长;免疫组织化学染色显示,达塞布韦与CR-31给药后,瘤组织Ki67水平均发生显著降低;Western blot结果显示,达塞布韦与CR-31给药后,瘤组织中NDUFA1,ATP5D,COX6B1的蛋白水平也显著降低;而达塞布韦对肿瘤的抑制率较CR-31更高,且体重减轻程度也较CR-31处理组小鼠更小。心、肝、脾、肺和肾的HE染色结果显示,与CR-31相比,达塞布韦对小鼠具有更小的内脏毒性作用。结论1.EIF4A1在胃癌组织中高表达,且与胃癌患者预后呈负相关。2.EIF4A1通过促进线粒体电子传递链相关功能蛋白的翻译,上调线粒体氧化磷酸化水平,进而促进胃癌的生长。3.达塞布韦通过靶向eIF4A1抑制线粒体氧化磷酸化并且促使活性氧的产生,从而抑制胃癌的生长。4.达塞布韦作为一种已经临床应用的抗病毒药物,相较目前仅限于实验应用的eIF4A1已知抑制剂CR-31具有相同的抑制胃癌作用,并具有更好的安全性。