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本研究的目的是开发防治化疗骨髓保护作用的药物,以应对恶性肿瘤大剂量化疗或者血液恶性病的治疗过程中所带来的骨髓抑制副作用。在本实验室前期工作的基础上,我们利用原核表达pET系统表达了重组人的MIG蛋白,并利用离子交换层析方法纯化出具有生物学活性的人MIG蛋白,为MIG的功能研究打下了基础。
我们选取50ug/kg体重的剂量,连续5天给小鼠皮下注射rHuMIG,再连续3天给小鼠进行腹腔注射5-Fu(100mg/kg体重/天),观察rHuMIG对5-Fu化疗小鼠的保护作用。对照组注射等体积生理盐水。统计发现,提前注射rHuMIG可以将小鼠的存活时间由对照组的7.36天提高到9.91天,并且二者在统计学上有极显著差异(P=0.0046)。该实验证明了提前运用rHtJMIG蛋白能够提高小鼠对5-Fu的耐受力,对小鼠化疗起到保护作用。
为了进一步探讨MIG保护骨髓的机制,我们对化疗恢复期小鼠注射rHuMIG,然后分离其骨髓单个核细胞,进行细胞周期检测,发现rHuMIG能够降低单个核细胞处于S期的比例。取正常小鼠的骨髓细胞,用Ficoll分离后体外进行集落培养,发现培养基中加入rHuMIG的培养皿中集落总数降低。由此,我们推测rHuMIG通过抑制造血干、祖细胞进入S期,从而避过S期敏感的化疗药物5-Fu的作用,使得化疗过程中更多的干、祖细胞存留下来并进入分裂增殖,加快骨髓的恢复。
CXCR3是MIG蛋白的受体,主要介导MIG完成趋化作用。我们检测了21种肿瘤细胞表面CXCR3的表达情况,发现其中有10种肿瘤细胞表面完全表达或部分表达CXCR3。通过MTT法检测了rHuMIG对表达CXCR3和不表达CXCR3肿瘤细胞增殖的影响,发现rHuMIG在体外不影响肿瘤细胞的增殖生长。
我们选用了表达CXCR3的L1210和不表达CXCR3的LLC两株肿瘤细胞,制作皮下肿瘤模型,在正常荷瘤小鼠模型中连续5天以50ug/kg体重的剂量皮下注射rHuMIG蛋白,观察rHuMIG体内对L1210和LLC肿瘤生长的影响,结果发现rHuMIG蛋白组的肿瘤重量和对照组相比无显著差异。在正常L1210荷瘤模型中,第11天处死小鼠,和在化疗L1210荷瘤模型中第9天处死小鼠,检测其外周血白细胞,血小板以及骨髓细胞总数的变化,结果发现,和对照组相比,蛋白组小鼠的外周血白细胞,血小板以及骨髓细胞总数均有所下降,但在统计学上无显著差异。在LLC荷瘤小鼠化疗模型中,化疗前连续5天注射rHuMIG蛋白,在化疗后第3、5、11天处死小鼠,检测其外周血白细胞,血小板以及骨髓细胞总数的变化。结果发现:在化疗后的第3天蛋白组白细胞下降(p值为0.14),血小板和骨髓细胞均上升(p值分别为0.003、0.009)。第5天蛋白组白细胞、血小板和骨髓细胞的数目和对照比相差很小,且统计学上无差异。第11天蛋白组白细胞、血小板的数目和对照组相比均有所上升,蛋白组骨髓细胞和对照组相比有所下降,但蛋白组实验数据和对照组相比在统计学上均无显著差异。可能的原因,推测为肿瘤在体内能分泌和造血相关的细胞因子,掩盖了rHuMIG在化疗过程中对造血系统重建的影响。
综合以上试验结果,我们可以初步得出结论:在化疗前,运用rHuMIG能够在小鼠化疗后有助于小鼠骨髓抑制的恢复,这为开发rHuMIG作为临床化疗保护剂奠定了实验基础。