荧光原位杂交是一种有力的细胞遗传学研究工具,现广泛应用于基因的定位、染色体结构的研究、细胞遗传图谱和染色体图谱的构建。甘蓝作为芸(?)属三个基本种之一,也是芸(?)属基因组计划研究对象之一,因此,利用荧光原位杂交技术,构建甘蓝的染色体图谱以及细胞遗传图谱,直观地展现基因、分子标记等在染色体上的具体位置,成为甘蓝分子细胞遗传学研究的主要内容。同时,自交不亲和作为甘蓝防止自交的一种重要生殖隔离方式,其信号传导途径除受一个带有复等位基因的多态性S位点(S-locus)控制外,还与另一些信号传导元件(MLPK.ARCl.SSP等)密切相关。但是,关于这条信号传导途径相关元件编码基因与S位点之间的连锁关系、以及它们在甘蓝染色体上的具体位置分布情况还有待研究。本研究以自交不亲和甘蓝为材料,采用荧光原位杂交技术,将重复序列5S rDNA.标记位点(pO147、pR94和pN120)以及自交不亲和基因MLPK和SRK分别进行染色体定位研究,旨在构建甘蓝染色体图谱以及细胞遗传图谱,明确自交不亲和基因在染色体的具体位置及连锁关系,这对芸(?)属基因组计划和自交不亲和的机理研究具有非常重要的意义。主要研究结果如下.1.靶DNA载体的制备：利用甘蓝的根尖、花蕾、以及幼叶,成功地制备出不同伸长度的靶DNA载体,包括甘蓝根尖和绒毡层细胞的中期染色体、粗线期染色体和伸展DNA纤维。A.甘蓝根尖中期染色体制备：在暗培养条件下采用变温同步化处理根尖,明显提高了根尖细胞中期分裂相；根尖预处理采用的是0.002 mol／L 8-羟基喹啉预处理1 h,获得了最佳的效果；2%纤维素酶和2%果胶酶混合液在37℃水浴锅中酶解约40～90min,并进行前后低渗,可以获得分散良好、背景较低的根尖中期染色体分裂相；B.绒毡层细胞中期染色体以及粗线期染色体的制备：以田间采取的花蕾为材料,70%乙醇中-20℃保存备用,保存时间在3个月内；选取具有理想分裂相的花药,在2%(w／v)纤维素酶和2%(w／v)果胶酶的混合酶液中酶解60 min,可以获得染色体分散、背景较低的染色体制片；C.伸展DNA纤维的制备：采用匀浆法获得分布均匀、杂质较少、密度适中的细胞核；采用分子梳理法制备出伸展度良好、密度合适以及平行的DNA纤维。2. FISH体系的建立：通过荧光原位杂交相关参数的探索,建立了适合不同伸长度的靶DNA载体FISH体系。对中期和粗线期染色体制片采用相同的处理步骤,而DNA纤维制片无需进行蛋白酶处理和预变性。A.片子的预处理：100μ/mL的RNase A 37℃处理1 h可以增强杂交的信噪比；500ug/mL胃蛋白酶在37℃处理40 mmin可以有效的去除蛋白质；70%去离子甲酰胺中70℃变性2 min可获得较好的杂交效果。B.杂交混合液组成：去离子甲酰胺50%；硫酸葡聚糖7.5%；2×SSC；1.5 ng/μL探针；0.5%SDS；0.5μg/Lц鱼精DNA。C.洗脱条件：重复拷贝基因,洗脱温度42℃,洗脱时间8 min；低拷贝或单拷贝基因,洗脱温度37℃,洗脱时间5 min；如果靶DNA为DNA纤维时,洗脱温度40℃,洗脱时间5 min。3.甘蓝根尖中期染色体的核型分析：甘蓝体细胞染色体数2n=18,其核型公式为K(2n)=18=12m+6sm,其中1、2、4、5、6和8号染色体为中部着丝粒染色体,3、7和9号染色体为近中部着丝粒染色体；7号染色体的短臂末端具有随体；甘蓝的核型属于2A型,即对称型核型。4.高分辨率5S rDNA-FISH研究：以羽衣甘蓝为实验材料,采用荧光原位杂交技术将DIG标记的5S rDNA探针定位于不同分辨率的绒毡层细胞中期染色体、粗线期染色体以及伸长DNA纤维上,目的是明确羽衣甘蓝5S rDNA在染色体的分布和具体拷贝数情况,为进一步利用FISH进行基因定位和细胞遗传图谱构建奠定基础。在中期染色体和粗线期染色体上,都同时获得3个杂交信号位点(a、b、c),且位于2号染色体的长臂近着丝粒区域,其信号强度为b>a>c；而在伸长DNA纤维上,出现了3种不同长度的念珠状长链(a、b、c),其物理大小分别为257 kb、359 kb和134 kb,粗略估算出3个5S rDNA位点的拷贝数分别为510、712和266。5.甘蓝2号染色体细胞遗传图普的构建：以甘蓝第4连锁群上的3个标记位点(p0147、pR94和pN120)和5S rDNA为探针,并分别用生物素和地高辛标记,然后与甘蓝绒毡层细胞中期染色体和粗线期染色体进行双色荧光原位杂交,构建甘蓝2号染色体细胞遗传图谱,明确分子标记在染色体上的真实距离。A.标记探针的获得：采用探针加长法即将p0147的序列长度增加为8 kb左右,pR94的长度增加到2.5 kb,pN120的长度增加为3.2 kb,提高了杂交的检出率。B.采用3种长度的探针对杂交检出率的探索：探针长度为2 kb时,其检出率为9.8%；探针长度为4.5 kb时,检出率约有提高,达到16.7%,而当探针长度达到8 kb时,探针的检出率增长为20.2%。C.2号染色体细胞遗传图谱：探针pO147、pR94和pN120均定位于甘蓝2号染色体的短臂(2S),细胞遗传位置分别为为2S.13、2S.9和2S.15。6.自交不亲和基因MLPK和SRK的定位：以MLPK和SRK基因序列为探针,分别在甘蓝绒毡层细胞中期染色体、减数分裂粗线期染色体上进行双色荧光原位杂交,确定MLPK和SRK在染色体上的分布情况和拷贝数。MLPK位于第2条染色体的短臂中部,细胞遗传位置为2S.17；SRK位于甘蓝的4号染色体的长臂中部,细胞遗传位置为4L.80。在中期染色体上,MLPK探针的检出率为10.2%,SRK探针的检出率为12.2%；在粗线期染色体上,MLPK的信号检出率为26.9%,SRK探针的检出率为33.7%。7.甘蓝染色体图谱：第4连锁群的遗传标记位点(pR94、pO147、pN120)、自交不亲和基因MLPK以及高度重复的5S rDNA序列都同时位于甘蓝的2号染色体上,SRK基因位于7连锁群即第4号染色体的长臂。