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【目的】
微小RNA（MicroRNA，miRNA）是内源性非编码小分子RNA，可通过调控靶基因的表达参与肿瘤发生发展过程。鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma，NPC）是发生于鼻咽黏膜的恶性肿瘤，且恶性程度高，早期诊断较难，易发生颈部淋巴结转移。我们前期对公共芯片数据进行分析，发现miR-199a-3p在鼻咽癌组织中低表达，因此本研究拟通过体内外实验和临床样本分析，探讨miR-199a-3p在鼻咽癌发生发展中的作用机制及临床诊断意义，为鼻咽癌的分子靶向治疗提供新的科学依据。
【方法】
（1）结合公共数据库中鼻咽癌microRNA芯片信息分析、临床鼻咽癌组织标本和实验室鼻咽癌细胞系样品，分析miR-199a-3p在鼻咽癌中的表达情况。通过Targetscan网站预测miR-199a-3p的靶基因，从靶基因中筛选出评分较高且与脂肪酸代谢相关的基因SCD1。利用鼻咽癌病理组织切片做免疫组化检测临床鼻咽癌组织和癌旁组织中miR-199a-3p预测靶基因的蛋白表达。
（2）根据鼻咽癌细胞系中miR-199a-3p的表达水平确定待研究的鼻咽癌细胞株，并优化转染条件。通过划痕实验、transwell小室迁移和侵袭实验，检测miR-199a-3p对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响，并通过RT-qPCR实验和westernblot实验检测侵袭迁移及上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）相关基因和蛋白的表达水平变化。
（3）通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-199a-3p的预测靶点。再用westernblot实验和RT-qPCR实验进行靶点的验证。
（4）通过气相色谱法分析miR-199a-3p对鼻咽癌细胞脂肪酸代谢的影响。Transwell小室迁移和侵袭实验、westernblot实验检测油酸(oleicacid，OA)对鼻咽癌细胞侵袭转移和SCD1表达的影响。
（5）构建过表达SCD1质粒载体，采用westernblot检测SCD1质粒转染、SCD1质粒联合miR-199a-3pmimic转染条件下相关蛋白的表达。用PI3K抑制剂LY294002处理细胞，观察PI3K-Akt信号通路相关蛋白的表达变化。
（6）将CNE-2、5-8F细胞分别接种于裸鼠皮下，再分别随机分组为agomir-NC组和agomir-199a-3p组后，进行瘤内注射，观察各处理组肿瘤的生长，并采用RT-qPCR实验和免疫组化技术检测动物肿瘤模型中脂肪酸代谢、侵袭转移EMT相关分子的表达变化。
【结果】
（1）通过公共数据库芯片结果分析和对临床组织标本miR-199a-3p表达量的检测，我们发现miR-199a-3p在鼻咽癌组织中表达明显低于癌旁组织或鼻咽炎症组织的表达。Targetscan网站预测SCD1为miR-199a-3p的靶基因，临床鼻咽癌病理组织切片免疫组化结果也显示SCD1在鼻咽癌组织中的表达显著高于癌旁组织。此外，我们实验室的鼻咽癌细胞系验证结果也发现，相比于永生化的鼻咽上皮细胞NP69，miR-199a-3p在鼻咽癌细胞系中低表达。根据miR-199a-3p的表达情况，后续实验选择5-8F和CNE-2作为研究细胞。
（2）划痕实验、transwell迁移实验和侵袭实验发现miR-199a-3pmimic转染5-8F和CNE-2细胞后，其迁移能力及侵袭能力明显减弱；westernblot实验结果显示N-Cadherin、MMP2、MMP9的蛋白表达水平显著降低，E-Cadherin的蛋白表达水平显著升高；RT-qPCR结果发现侵袭转移相关的部分基因表达水平也显著降低。相反，划痕实验、transwell迁移实验和侵袭实验结果显示miR-199a-3pinhibitor转染5-8F和CNE-2细胞后，其迁移能力及侵袭能力显著增强；westernblot实验结果显示N-Cadherin、MMP2、MMP9的蛋白表达水平明显增加，E-Cadherin的蛋白表达水平降低；RT-qPCR结果发现侵袭转移相关的部分基因表达水平也明显升高。
（3）wt-SCD13UTR双荧光素酶质粒与miR-199a-3pmimic共转染A549细胞后，检测到荧光素酶活性显著下降，证明SCD1是miR-199a-3p的作用靶点。miR-199a-3pmimic转染5-8F和CNE-2细胞后，westernblot实验结果显示SCD1蛋白水平明显降低，与此相反，miR-199a-3pinhibitor转染5-8F和CNE-2细胞后，westernblot实验结果显示SCD1蛋白水平明显升高。RT-qPCR实验也得到了相似的结果。
（4）气相色谱分析结果表示，与NC转染组相比，转染miR-199a-3pmimic后的5-8F和CNE-2细胞C16:0/C16:1和C18:0/C18:1比值增大，相反的，转染miR-199a-3pinhibitor后的5-8F和CNE-2细胞C16:0/C16:1和C18:0/C18:1比值减小。Transwell小室迁移和侵袭实验、westernblot实验结果显示油酸C18:1处理5-8F和CNE-2细胞后，鼻咽癌细胞的侵袭迁移能力明显受到促进。N-Cadherin、MMP2、MMP9蛋白水平明显升高，PTEN、E-Cadherin蛋白水平明显降低。
（5）用过表达质粒载体上调SCD1表达水平后，PI3K-Akt信号通路被激活；但PI3K抑制剂LY294002可抑制miR-199a-3pinhibitor引起的p-Akt、N-Cadherin、MMP2、MMP9蛋白的升高和E-Cadherin蛋白的降低。
（6）动物实验结果表明，瘤内注射agomiR-199a-3p可抑制5-8F和CNE-2细胞在裸小鼠的肿瘤形成能力，其后续的RT-qPCR实验结果显示，与瘤内注射agomiR-NC组相比，agomiR-199a-3p组小鼠肿瘤组织中miR-199a-3p表达水平明显较高，而SCD1的表达水平相应较低。免疫组化实验结果表明，SCD1和MMP2的表达水平降低，而PTEN和E-Cadherin的表达水平升高。
【结论】
microRNA-199a-3p在鼻咽癌组织和细胞中明显低表达；SCD1是miR-199a-3p的靶基因，SCD1在鼻咽癌组织和细胞中高表达；miR-199a-3p可通过靶向调控SCD1的表达及脂肪酸代谢进而抑制鼻咽癌细胞的EMT及侵袭转移能力；miR-199a-3p通过调控PI3K-Akt信号通路抑制鼻咽癌的侵袭转移能力。
微小RNA（MicroRNA，miRNA）是内源性非编码小分子RNA，可通过调控靶基因的表达参与肿瘤发生发展过程。鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma，NPC）是发生于鼻咽黏膜的恶性肿瘤，且恶性程度高，早期诊断较难，易发生颈部淋巴结转移。我们前期对公共芯片数据进行分析，发现miR-199a-3p在鼻咽癌组织中低表达，因此本研究拟通过体内外实验和临床样本分析，探讨miR-199a-3p在鼻咽癌发生发展中的作用机制及临床诊断意义，为鼻咽癌的分子靶向治疗提供新的科学依据。
【方法】
（1）结合公共数据库中鼻咽癌microRNA芯片信息分析、临床鼻咽癌组织标本和实验室鼻咽癌细胞系样品，分析miR-199a-3p在鼻咽癌中的表达情况。通过Targetscan网站预测miR-199a-3p的靶基因，从靶基因中筛选出评分较高且与脂肪酸代谢相关的基因SCD1。利用鼻咽癌病理组织切片做免疫组化检测临床鼻咽癌组织和癌旁组织中miR-199a-3p预测靶基因的蛋白表达。
（2）根据鼻咽癌细胞系中miR-199a-3p的表达水平确定待研究的鼻咽癌细胞株，并优化转染条件。通过划痕实验、transwell小室迁移和侵袭实验，检测miR-199a-3p对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响，并通过RT-qPCR实验和westernblot实验检测侵袭迁移及上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）相关基因和蛋白的表达水平变化。
（3）通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-199a-3p的预测靶点。再用westernblot实验和RT-qPCR实验进行靶点的验证。
（4）通过气相色谱法分析miR-199a-3p对鼻咽癌细胞脂肪酸代谢的影响。Transwell小室迁移和侵袭实验、westernblot实验检测油酸(oleicacid，OA)对鼻咽癌细胞侵袭转移和SCD1表达的影响。
（5）构建过表达SCD1质粒载体，采用westernblot检测SCD1质粒转染、SCD1质粒联合miR-199a-3pmimic转染条件下相关蛋白的表达。用PI3K抑制剂LY294002处理细胞，观察PI3K-Akt信号通路相关蛋白的表达变化。
（6）将CNE-2、5-8F细胞分别接种于裸鼠皮下，再分别随机分组为agomir-NC组和agomir-199a-3p组后，进行瘤内注射，观察各处理组肿瘤的生长，并采用RT-qPCR实验和免疫组化技术检测动物肿瘤模型中脂肪酸代谢、侵袭转移EMT相关分子的表达变化。
【结果】
（1）通过公共数据库芯片结果分析和对临床组织标本miR-199a-3p表达量的检测，我们发现miR-199a-3p在鼻咽癌组织中表达明显低于癌旁组织或鼻咽炎症组织的表达。Targetscan网站预测SCD1为miR-199a-3p的靶基因，临床鼻咽癌病理组织切片免疫组化结果也显示SCD1在鼻咽癌组织中的表达显著高于癌旁组织。此外，我们实验室的鼻咽癌细胞系验证结果也发现，相比于永生化的鼻咽上皮细胞NP69，miR-199a-3p在鼻咽癌细胞系中低表达。根据miR-199a-3p的表达情况，后续实验选择5-8F和CNE-2作为研究细胞。
（2）划痕实验、transwell迁移实验和侵袭实验发现miR-199a-3pmimic转染5-8F和CNE-2细胞后，其迁移能力及侵袭能力明显减弱；westernblot实验结果显示N-Cadherin、MMP2、MMP9的蛋白表达水平显著降低，E-Cadherin的蛋白表达水平显著升高；RT-qPCR结果发现侵袭转移相关的部分基因表达水平也显著降低。相反，划痕实验、transwell迁移实验和侵袭实验结果显示miR-199a-3pinhibitor转染5-8F和CNE-2细胞后，其迁移能力及侵袭能力显著增强；westernblot实验结果显示N-Cadherin、MMP2、MMP9的蛋白表达水平明显增加，E-Cadherin的蛋白表达水平降低；RT-qPCR结果发现侵袭转移相关的部分基因表达水平也明显升高。
（3）wt-SCD13UTR双荧光素酶质粒与miR-199a-3pmimic共转染A549细胞后，检测到荧光素酶活性显著下降，证明SCD1是miR-199a-3p的作用靶点。miR-199a-3pmimic转染5-8F和CNE-2细胞后，westernblot实验结果显示SCD1蛋白水平明显降低，与此相反，miR-199a-3pinhibitor转染5-8F和CNE-2细胞后，westernblot实验结果显示SCD1蛋白水平明显升高。RT-qPCR实验也得到了相似的结果。
（4）气相色谱分析结果表示，与NC转染组相比，转染miR-199a-3pmimic后的5-8F和CNE-2细胞C16:0/C16:1和C18:0/C18:1比值增大，相反的，转染miR-199a-3pinhibitor后的5-8F和CNE-2细胞C16:0/C16:1和C18:0/C18:1比值减小。Transwell小室迁移和侵袭实验、westernblot实验结果显示油酸C18:1处理5-8F和CNE-2细胞后，鼻咽癌细胞的侵袭迁移能力明显受到促进。N-Cadherin、MMP2、MMP9蛋白水平明显升高，PTEN、E-Cadherin蛋白水平明显降低。
（5）用过表达质粒载体上调SCD1表达水平后，PI3K-Akt信号通路被激活；但PI3K抑制剂LY294002可抑制miR-199a-3pinhibitor引起的p-Akt、N-Cadherin、MMP2、MMP9蛋白的升高和E-Cadherin蛋白的降低。
（6）动物实验结果表明，瘤内注射agomiR-199a-3p可抑制5-8F和CNE-2细胞在裸小鼠的肿瘤形成能力，其后续的RT-qPCR实验结果显示，与瘤内注射agomiR-NC组相比，agomiR-199a-3p组小鼠肿瘤组织中miR-199a-3p表达水平明显较高，而SCD1的表达水平相应较低。免疫组化实验结果表明，SCD1和MMP2的表达水平降低，而PTEN和E-Cadherin的表达水平升高。
【结论】
microRNA-199a-3p在鼻咽癌组织和细胞中明显低表达；SCD1是miR-199a-3p的靶基因，SCD1在鼻咽癌组织和细胞中高表达；miR-199a-3p可通过靶向调控SCD1的表达及脂肪酸代谢进而抑制鼻咽癌细胞的EMT及侵袭转移能力；miR-199a-3p通过调控PI3K-Akt信号通路抑制鼻咽癌的侵袭转移能力。