目的:肺癌包括非小细胞肺癌（Non–small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌两种,非小细胞肺癌约占肺癌总数的85%,主要包括肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）和肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC）两种病理类型,其中肺腺癌是目前最主要的病理类型。肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,根据2017年最新的肿瘤统计数据,肺癌是发病率第二、死亡率最高的恶性肿瘤。尽管肺癌的诊断和治疗有了快速进展,肺癌的预后仍很差,这是由于肺癌发生发展的分子机制尚不完全清楚,因此对肺癌发生发展的分子机制的探索为提高其诊断和治疗奠定了重要基础。恶性肿瘤发生发展是多基因综合作用的结果,其中mRNA及其编码的蛋白质在肿瘤发生发展中有广泛而重要的作用。近年来,非编码RNA（non-conding RNA,ncRNA）得到广泛关注。非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA,人类基因组有超过90%的基因转录为RNA但并未编码为蛋白质。非编码RNA可分为管家非编码RNA和调节非编码RNA,其中调节非编码RNA中的微小RNA（miRNA）可参与基因表达的转录后调节,miRNA可以通过抑制肿瘤相关基因,在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。长链非编码RNA（lncRNA）在肿瘤中也发挥基因调节作用,其吸附miRNA,通过miRNA影响其下游靶基因是lncRNA发挥调节作用的机制之一。环状RNA（Circular RNAs,circRNAs）是最近新发现的一种非编码RNA,以共价结合的闭合环状形式存在。环状RNA具有表达丰度高、稳定存在,在人和鼠中具有保守性,具有细胞和组织特异性表达等特征。随着技术发展,发现某些环状RNA在肿瘤中存在差异表达,进一步研究发现环状RNA参与肿瘤的发生发展,此外环状RNA对肿瘤的诊断和预后也有重要价值。环状RNA可以吸附miRNA从而解除miRNA对下游靶基因的抑制作用,捕获RNA结合蛋白（RNA-binding protein,RBP）,并可作为转录调节因子。其中环状RNA作为miRNA海绵从而调节靶基因表达是迄今为止我们知道环状RNA的最重要作用机制。肺癌中环状RNA的研究尚处于起始阶段,研究报道了少数环状RNA参与肺癌的发生发展。cir-ITCH在肺癌组织中表达水平较低,发挥抑癌作用;此外,环状RNA hsa_circ₀014130、hsa_circ₀000064、hsa_circ₀007385、hsa_circ₀013958在肺癌中作为癌基因,促进肺癌发生发展。最近的研究表明circPUM1在卵巢癌中表达上调,并且能够促进卵巢癌的发生发展,因此我们提出假设circPUM1在肺癌特别是肺腺癌发生发展中也发挥作用。因此,本研究旨在探索circPUM1在肺腺癌组织及细胞系中的表达水平及其对肺腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭和转移的影响,并研究circPUM1影响肺腺癌细胞生物学行为可能的分子机制。研究方法:1.组织标本及RNA提取选取中国医科大学附属第一医院胸外科住院的肺腺癌患者,所有患者均经至少两名病理学家确认为肺腺癌。收取其癌组织和癌旁组织,于-80℃冰箱保存。加入1ml trizol试剂,按照操作说明提取RNA,检测260和280nm处吸光度值得到RNA的浓度和纯度。利用pomega逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。本研究经中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准。2.qPCR检测组织标本及细胞系环状RNA表达水平Takara实时定量试剂盒检测肺腺癌患者癌组织和癌旁组织中环状RNA circPUM1的表达水平,按照操作说明在Roche lightcycler 480实时定量PCR仪上进行,每次反应均包含阳性及阴性质控。采用18s作为内参进行标准化,2^-ΔΔCT方法计算相对表达量。所用的前向引物为:5’-AGTGTACTGGGAGGAGG-3’,反向引物为:5’-ATAAGTCCGTGCGTCC-3’。人肺腺癌细胞系A549、H1975、SPC-A1以及人正常肺上皮细胞16HBE细胞接种于6孔板,待次日长满后加入1 ml trizol试剂将细胞裂解,按照操作说明提取RNA。Takara实时定量试剂盒检测几种细胞系中环状RNA circPUM1的表达水平。3.细胞培养及转染人肺腺癌细胞系A549、H1975、SPC-A1以及人正常肺上皮细胞16HBE均购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。其中A549细胞用含10%胎牛血清的F12培养液,H1975、SPC-A1细胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液,而16HBE细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养液。所有细胞均在37℃、5%CO₂、湿度饱和的孵箱中进行培养,每2-3天更换培养液。环状circPUM1过表达及sh质粒分别由吉赛公司和汉恒生物科技有限公司构建。选取circPUM1高表达的细胞系转染shRNA质粒降低其表达水平,选择低表达的细胞系转染过表达质粒升高其表达水平。采用lipofactomine 3000进行转染实验,之后加入嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。4.MTT细胞活性测定将3×10³个转染过表达或shRNA质粒的细胞接种到96孔板中,每次设置对照孔及空白孔。分别在0h、24h、48h、72h,将20μl MTT溶液加到铺好细胞的96孔板中,孵育1-4小时后,加入二甲基亚砜（DMSO）酶标仪读取490nm的吸光度值。5.EdU检测DNA合成能力细胞接种于24孔板,第二天以10μM的EdU标记6-8h,孵育之后用4%多聚甲醛固定细胞,用Alexa Fluor 488标记EdU,并且用Hoechst 33342染细胞核,PBS洗两次,荧光显微镜下拍照。Image J软件分析EdU阳性细胞的百分比。6.细胞凋亡检测收集细胞后,用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗两次,按操作说明,每管加入5μl Annexin V-APC和5μl 7-AAD混匀,室温避光15分钟后上流式细胞仪检测细胞凋亡率。7.细胞划痕实验细胞接种于6孔板中,培养到细胞汇合度80%左右时,用200ul枪尖划痕,细胞用PBS洗两次并在无血清的培养液中培养。分别在0、24、48小时时在显微镜下观察划痕并拍照。用Image J软件测量划痕区域,划痕愈合率=（原划痕面积-不同时间点划痕面积）/原划痕面积*100%。8.Transwell细胞侵袭实验明胶基质包被的transwell细胞培养小室用来进行侵袭实验。5×10⁴个A549细胞或SPC-A1细胞重悬于200ul无血清培养液中,平铺于transwell小室的上层,底层含有600ul完全培养液作为趋化剂。37℃孵育48小时后,用棉签去除小室上层的细胞,侵袭到上层小室底部的细胞用甲醛固定,结晶紫染色并用显微镜拍照。9.荧光素酶报告基因实验293T细胞接种于96孔板中,并转染野生型或突变型荧光素酶质粒（汉恒）及相应的miRNA。孵育48h后双荧光素酶报告系统检测firefly和renilla荧光素酶活性。相对荧光信号以firefly荧光素酶活性/renilla荧光素酶活性表示。10.裸鼠体内成瘤实验4周大的免疫缺陷BALB/c裸鼠购自北京维通利华公司,在中国医科大学动物部饲养。转染sh-circPUM1和sh-NC质粒的A549细胞收获、清洗并重悬于PBS中,1×10⁷细胞（0.1 ml）接种到裸鼠皮下。每3天监测肿瘤大小,并按照如下公式计算肿瘤体积:肿瘤体积（mm³）=长×宽²/2,40天后将老鼠处死。11.Western blot检测蛋白质水平总蛋白收获并用RIPA裂解液（包含蛋白酶抑制剂）裂解。蛋白裂解物经10%SDS-聚丙烯凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜上。3%BSA室温封闭膜两个小时,之后加入一抗,4℃过夜孵育。二抗室温孵育2小时后,用凝胶图像分析仪采集图像并分析。12.统计学分析应用SPSS 20.0软件进行统计学分析,计量数据两组均值比较采用t检验,计数资料比较采用卡方检验。p≤0.05认为有统计学差异。结果:1.肺腺癌患者癌组织及肺腺癌细胞系中circPUM1表达增高qPCR检测肺腺癌患者癌组织和癌旁组织标本circPUM1表达水平,结果显示癌组织中circPUM1水平显著高于癌旁组织（p<0.05）,且与肿瘤TNM分期相关,TNM分期越高表达水平越高。此外,三种肺腺癌细胞系及人正常肺上皮细胞16HBE中检测circPUM1表达水平,结果发现肺腺癌细胞中circPUM1表达水平高于人肺正常上皮细胞。其中A549细胞表达水平较高,因此选择A549细胞转染sh-circPUM1质粒进行circPUM1敲减;SPC-A1细胞表达水平较低,选择对其进行circPUM1过表达。2.circPUM1影响肺腺癌细胞增殖首先进行MTT实验评估circPUM1对细胞增殖的影响,A549细胞进行circPUM1敲减后,OD490吸光度值降低（p<0.05）提示其细胞增殖能力显著降低;而SPC-A1细胞过表达circPUM1后,OD490吸光度值升高（p<0.05）细胞增殖能力明显增强。此外,我们还进行了EdU细胞增殖实验评估circPUM1敲除或过表达对DNA复制水平的影响。结果显示A549细胞进行circPUM1敲减后,EdU阳性细胞的百分比显著降低（p<0.05）,而SPC-A1细胞过表达circPUM1后,EdU阳性细胞的百分比增高（p<0.05）。3.circPUM1影响肺腺癌细胞凋亡A549细胞转染sh-circPUM1质粒后,细胞凋亡水平均较对照组显著增加（p<0.05）;而SPC-A1细胞转染circPUM1质粒后,细胞凋亡水平显著降低（p<0.05）。4.circPUM1影响肺腺癌细胞迁移和侵袭能力划痕实验中A549细胞转染sh-circPUM1质粒后,48h划痕愈合百分比较对照组显著降低（p<0.05）;Transwell结果显示A549细胞敲减circPUM1后,侵袭到下室的细胞数较对照组显著减少（p<0.05）。而SPC-A1细胞过表达circPUM1后,得到完全相反的结果。5.circPUM1敲减抑制裸鼠体内成瘤裸鼠移植瘤模型体内验证circPUM1在肺腺癌肿瘤发生发展中的作用。裸鼠被随机分为两组,分别皮下接种转染sh-circPUM1和sh-NC的A549细胞。与对照组比较,sh-circPUM1组裸鼠的肿瘤生长速度明显较慢,相同的观察时间内肿瘤体积较小（p<0.05）。6.circPUM1与miRNA相互作用Circular RNA Interactome网站预测circPUM1存在miR-326互补序列,提示两者可能存在相互作用。荧光素酶双报告基因实验显示miR-326能显著降低野生型circPUM1荧光素酶质粒的相对荧光活性（p<0.05）,而对突变型circPUM1荧光素酶质粒的相对荧光活性无显著影响。结果提示circPUM1可作为miR-326海绵吸附miR-326。7.miR-326下游靶蛋白检测Western blot结果显示,与对照组比较,circPUM1过表达显著上调cyclin D1（CCND1）和Bcl-2的蛋白表达水平;相反,circPUM1敲减后CCND1和Bcl-2的表达水平降低。结论:1.环状RNA circPUM1在肺腺癌患者癌组织中表达水平较癌旁组织高,且与肿瘤TNM分期相关。2.体外功能试验显示:环状RNA circPUM1能够促进肺腺癌细胞增殖、抑制其凋亡,并能够促进其侵袭和迁移能力。3.体内敲减circPUM1表达能够显著抑制裸鼠体内成瘤。4.环状RNA circPUM1通过吸附miR-326,进而调节其下游蛋白Cyclin D1、Bcl-2表达,从而影响肺腺癌的发生、发展。5.研究揭示了circPUM1在肺癌中的分子调节作用,circPUM1调节网络的阐明能够加速对肺癌发生发展的研究。此外,circPUM1-miR-326轴可能作为肺腺癌及其它相关疾病的潜在治疗靶点,改善其临床干预。