论文部分内容阅读
背景与目的非小细胞肺癌包括腺癌和鳞状细胞癌,是所有癌症中最常见的类型,也是全世界癌症相关死亡的最主要原因之一。由于非小细胞肺癌的早期通常没有症状,大部分患者在疾病晚期才被确诊。近年来,尽管外科手术和放化疗治疗方法已经取得了长足的进步,肺癌的预后仍然令人沮丧,其5年生存率只有15%。因此,揭示非小细胞肺癌发展的分子机制,寻找新的非小细胞肺癌的诊断标志物及治疗靶点尤为重要,也是肺癌研究领域的难点。最近的一项研究用微阵列的方法检测了人肺腺癌样品中特异表达的长链非编码RNA,结果发现长链非编码RNA ENST00000434223在早期肺腺癌组织中表达下调,但是对于其在非小细胞肺癌发生发展中的功能和机制仍知之甚少。本课题拟分三个部分,揭示ENST00000434223与患者临床病理特征的关联性及其调控非小细胞肺癌发生发展的具体机制,运用过表达及si RNA敲低技术研究ENST00000434223对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的调控,并研究其对肿瘤细胞周期、凋亡及上皮-间质转变的影响,探讨ENST00000434223作为非小细胞肺癌潜在的早期诊断标志物及治疗靶点的可能性。第一部分长链非编码RNA ENST00000434223表达谱研究及其表达水平和临床病理特征的关联性分析目的:比较正常支气管上皮细胞与非小细胞肺癌细胞株中长链非编码RNA ENST00000434223的表达水平,以及56对人类非小细胞肺癌与其匹配的相邻非癌组织中ENST00000434223的表达水平,并分析ENST00000434223的表达水平与56位非小细胞肺癌病人的各项临床特征的相关性,探讨其作为非小细胞肺癌的早期诊断标志物及治疗靶点的可能性。方法:用TRIzol法抽取正常支气管上皮细胞及各非小细胞肺癌细胞的总RNA,反转录成c DNA,再用Real time-PCR比较两者中ENST00000434223的表达水平;用TRIzol法抽取56对人类非小细胞肺癌及与其匹配的相邻非癌组织的总RNA,反转录成c DNA,再用Real time-PCR比较两者中ENST00000434223的表达水平,并分析ENST00000434223的表达水平与56位非小细胞肺癌病人的各项临床特征的相关性。结果:细胞系Real time-PCR结果显示,与正常支气管上皮细胞系(16HBE)相比,长链非编码RNA ENST00000434223在非小细胞肺癌细胞系A549,SK-MES-1,SPC-A1和NCI-H1975中的表达水平均下调,其中,ENST00000434223在A549细胞中表达最高,在NCI-H1975细胞中表达最低。组织Real time-PCR检测发现与匹配的相邻正常组织相比,ENST00000434223在癌组织的表达水平显著下调(P<0.01),且低ENST00000434223表达水平与肿瘤直径(P<0.05),淋巴结转移(P<0.05),TNM分期(P<0.05)相关,但与其他因素,例如年龄、性别和肿瘤分化不相关。结论:长链非编码RNA ENST00000434223在非小细胞肺癌细胞株和非小细胞肺癌组织中均下调;长链非编码RNA ENST00000434223的低表达与肿瘤的大小、淋巴结转移和临床分期正相关,与年龄、性别及肿瘤分化无关。第二部分长链非编码RNA ENST00000434223抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和生长机制研究目的:确定长链非编码RNA ENST00000434223对非小细胞肺癌细胞增殖和生长的影响,并确定其是否通过调控非小细胞肺癌的细胞周期和凋亡来影响肺癌细胞增殖和生长。方法:用瞬时转染和si RNA技术过表达或敲低ENST00000434223,再用CCK-8细胞计数试剂盒检测其对肺癌细胞增殖的调控,并用免疫印迹的方法确定其对增殖细胞核内抗原PCNA蛋白水平的影响,然后再用流式细胞仪检测过表达或敲低ENST00000434223对细胞周期的调控,用免疫印迹确定其对细胞周期调控因子p21蛋白水平的影响,最后用PI染色的方法检测其对细胞凋亡的影响。另外,我们还建立了裸鼠异种移植模型,在裸鼠体内研究过表达ENST00000434223对肺癌细胞生长的影响。结果:H1975细胞的细胞存活率随着ENST00000434223的过表达而减少,而A549细胞的存活率随着ENST00000434223的敲低而相应增加。与此相符,ENST00000434223过表达的H1975细胞中细胞核抗原(PCNA)的蛋白水平降低了60%左右,ENST00000434223敲低的A549细胞中细胞核抗原(PCNA)的蛋白水平是对照细胞中的3倍。流式细胞分析检测发现ENST00000434223过表达诱发了H1975细胞在G0/G1期的阻滞,而敲低ENST00000434223则降低了A549细胞在G0/G1期的细胞所占百分比。与这些结果相一致,免疫印迹实验表明当ENST00000434223在H1975细胞中过表达时,p21蛋白水平提高为对照细胞的2倍,在A549细胞中敲低ENST00000434223表达后,p21蛋白水平则下降了60%左右。为了进一步确定ENST00000434223抑制非小细胞肺癌细胞增殖的功能是否通过诱导细胞凋亡,我们用流式细胞仪检测了当ENST00000434223在H1975细胞中过表达时的细胞凋亡情况,结果发现,ENST00000434223过表达显著增加了H1975细胞的凋亡(3-4倍)。与体外实验相一致,裸鼠异种移植模型实验表明过表达ENST00000434223的非小细胞肺癌细胞在裸鼠体内的生长显著降低。结论:ENST00000434223的过表达降低非小细胞肺癌细胞H1975细胞的存活率和该细胞中细胞核抗原(PCNA)的蛋白水平;敲低ENST00000434223的表达增加非小细胞肺癌细胞A549细胞的存活率和该细胞中细胞核抗原(PCNA)的蛋白水平;ENST00000434223过表达诱发了H1975细胞在G0/G1期的细胞阻滞,并上调p21蛋白水平;敲低ENST00000434223则降低了A549细胞在G0/G1期的细胞所占百分比及p21蛋白水平;ENST00000434223过表达显著增加了H1975细胞的凋亡3-4倍。过表达ENST00000434223的非小细胞肺癌细胞H1975在裸鼠体内的生长显著降低,且其Ki67的阳性率降低。这些结果表明,长链非编码RNA ENST00000434223可以通过诱导非小细胞肺癌细胞的G0/G1阻滞及凋亡来抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和生长。第三部分长链非编码RNA ENST00000434223抑制非小细胞肺癌细胞的转移和侵袭机制研究目的:确定长链非编码RNA ENST00000434223对非小细胞肺癌细胞转移和侵袭的影响,并确定其是否通过调控非小细胞肺癌的上皮-间质转变来影响肺癌细胞侵袭。方法:用瞬时转染和si RNA技术过表达或敲低长链非编码RNA ENST00000434223,再检测其对非小细胞肺癌细胞转移和侵袭的调控。上皮-间质转变(EMT)已经被证明可促进肿瘤的侵袭、转移,接下来我们用免疫组化及免疫印迹的方法检测过表达ENST00000434223对非小细胞肺癌细胞上皮-间质转变的影响,确定ENST00000434223是否通过调控上皮-间质转变来影响非小细胞肺癌细胞的转移和侵袭。结果:迁移和侵袭实验结果表明,过表达ENST00000434223显著降低了非小细胞肺癌细胞H1975的迁移和侵袭的能力,而敲低ENST00000434223则显著增加了非小细胞肺癌细胞A549的迁移和侵袭的能力。免疫荧光分析表明,ENST00000434223过表达的H1975细胞拥有更全面的上皮细胞形态,ENST00000434223过表达导致了E-钙粘蛋白水平显著增加,以及N-钙粘蛋白和波形蛋白表达的显著降低。免疫印迹分析证实了免疫荧光分析的结果:其中E-钙粘蛋白水平是对照细胞的4倍,而N-钙粘蛋白和波形蛋白的水平则分别为对照细胞的13%和19%。结论:ENST00000434223可以显著降低非小细胞肺癌细胞H1975的迁移和侵袭的能力;ENST00000434223过表达的H1975细胞拥有更全面的上皮细胞形态;ENST00000434223抑制非小细胞肺癌细胞的上皮-间质转变。这些结果表明,ENST00000434223可以通过抑制非小细胞肺癌细胞的上皮-间质转变来抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。