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目的:本课题前期实验表明,大黄、三七、丹参具有较强的抑制瘢痕成纤维细胞(HSF)增殖的作用,故进一步探索3种中药抗HSF增殖作用的物质基础,明确其中主要作用成分,研究其作用机制,并考察3种中药提取物抗HSF增殖的最佳配比。 方法:采用索氏提取法依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、饱和正丁醇和水对大黄、三七和丹参进行提取,制备各溶剂提取样品;以抗 HSF增殖的活性为导向,MTS法筛选各味中药的活性提取部位,筛选出的活性提取物采用流式细胞仪检测其对细胞周期的影响。采用 HPLC或 UPLC对其活性提取物进行谱效关系分析,Q/TOF推测出活性较高的成分,利用 PharmMapper数据库对活性化合物进行反向分子对接分析,将预测的靶点利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路数据库进行通路注释和分析,得出相关通路,预测其抗细胞增殖的机制。选取具有代表性的活性化合物,MTS实验和细胞 HE染色验证其抗增殖活性;以组分隐丹参酮为例,RT-PCR检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、双特异性丝裂原活化蛋白激酶1(MAP2K1)和丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)增殖相关基因的表达水平。最后采用D-最优混料设计,考察3种中药提取物抗HSF增殖的最佳配比。 结果:大黄乙酸乙酯提取物、三七乙酸乙酯提取物和丹参石油醚提取物有较高的抗 HSF增殖活性,流式细胞术结果显示这3个中药提取物均能显著增加 G0/G1期细胞的比例,显著降低S期和 G2/M细胞数的比例,明显降低增殖指数。 结合Q/TOF分析结果及文献报道,推测抗 HSF增殖抑制的主要成分分别是:大黄中的大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、没食子酸等;三七中的人参皂苷Rg1、三七皂苷R2、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1等;丹参中的二氢丹参酮I、丹参新醌B、隐丹参酮、次甲丹参醌和丹参酮II A等;反向对接结果显示,大黄活性成分可能通过CyclinA、CDK2等主要靶点,与Cell cycle、VEGF等信号通路相关;三七活性成分可能通过MAP2K1、MAPK14、HRAS等主要靶点,与MAPK、Focal adhesion等信号通路相关;丹参活性成分可能通过 MAP2K1、Caspase-3、MAPK14等主要靶点,与VEGF、MAPK、Focal adhesion等信号通路相关。 分别以大黄素、大黄酸、没食子酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1和隐丹参酮为例的验证结果显示,这几种成分均能抑制细胞的增殖且呈剂量依赖性;RT-PCR验证结果显示,隐丹参酮能够上调 Caspase-3基因的表达,同时下调MAP2K1、MAPK1基因的表达,与预测结果相吻合。 采用D-最优混料设计法考察出3种中药提取物抗HSF增殖的最佳配比为:丹参石油醚提取物为40％、大黄乙酸乙酯提取物为35%、三七乙酸乙酯提取物为25%。 结论:大黄、三七和丹参的主要活性成分分别为蒽醌类化合物、皂苷类、丹参酮类化合物,其作用的机制可能与调节MAPK、VEGF、Cell cycle、Focal adhesion等信号通路有关。丹参石油醚、大黄乙酸乙酯及三七乙酸乙酯提取物抗HSF增殖的最佳配比为8:7:5。