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目的 研究同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)对体外培养神经干细胞(neural stemcells，NSCs)增殖作用的影响，以及通过建立大脑中动脉栓塞(middle cerebralartrty occlusion，MCAO)模型，观察Hcy对局灶性脑缺血损伤大鼠神经干细胞增殖的作用，探讨Hcy基于DNA甲基化途径调控NSCs增殖的作用机制。 方法 采用无血清培养原代培养新生大鼠NSCs，将细胞随机分成4组:正常对照组（培养液中添加Hcy0μmol/l，Hcy-C组）、Hcy低剂量组（培养液中添加Hcy30μmol/l，Hcy-L组）、Hcy中剂量组（培养液中添加Hcy300μmol/l，Hcy-M组）、Hcy高剂量组（培养液中添加Hcy1 mmol/l，Hcy-H组，）。采用Cell Dimension软件对神经球直径进行测量;采用免疫荧光(Immunofluorescent, IF)检测NSCs标记物Brdu和Sox2的表达;采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测定试剂盒检测不同浓度Hcy作用下培养液中LDH的活力;采用DNA甲基化定量试剂盒检测不同Hcy浓度下细胞总甲基化水平;采用甲基转移酶活性检测试剂盒检测DNMTs总活性以及Western Blot检测DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)的蛋白表达;采用高效液相法(HPLC)检测细胞内S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine，SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(s-adenosylhomocysteine，SAH)的水平。 成年雄性SD(sprague-nawley)大鼠随机分假手术组(sham operation group，SO组)、大脑中动脉栓塞模型(middle cerebral artery occlusion group，MCAO组)以及大脑中动脉栓塞模型+同型半胱氨酸(middle cerebral artery occlusion+Hcygroup, MCAO+Hcy组)3组。SO组和MCAO组腹腔注射生理盐水5 ml/kg·bw·d，MCAO+Hcy组腹腔注射2％ Hcy溶液5 ml/kg·bw·d，注射28 d。通过Morris水迷宫实验检测大鼠的空间学习记忆能力;采用免疫组化法以及Western blot检测Sox2蛋白的表达;采用DNA甲基化定量试剂盒检测总甲基化水平;采用甲基转移酶活性检测试剂盒检测DNMTs总活性;采用Western Blot检测DNA甲基转移酶的蛋白表达。采用高效液相法(HPLC)检测大鼠血浆内Hcy、SAM、SAH的水平。 结果 用无血清培养原代培养新生大鼠NSCs6 d后，细胞聚集成球形团块，呈悬浮状态，Hcy添加组细胞神经球直径较对照组小，且差异均有统计学意义(P＜0.05)。Brdu和Sox2经免疫荧光双标记法鉴定均呈双阳性表达，Hcy添加组Brdu/Sox2双标阳性率较对照组小，且差异均有统计学意义(P＜0.05)。经LDH测定试剂盒检测，Hcy添加组细胞培养液中LDH活性较对照组升高，且差异均有统计学意义(P＜0.05）。DNA总甲基化水平检测结果显示:与对照组相比，Hcy添加组细胞总甲基化水平降低，差异均有统计学意义(P＜0.05）。DNMTs总活性检测结果显示:与对照组相比，Hcy添加组较对照组DNMTs总活性均下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)。Western Blot结果显示，与对照组相比，Hcy添加组DNMT1蛋白表达均下降，差异均有统计学意义（P＜0.05），Hcy-H组较Hcy-L组和Hcy-M组DNMT1蛋白表达下降，差异均有统计学意义(P＜0.05）;与对照组和Hcy-L组相比，Hcy-M组和Hcy-H组DNMT3a蛋白表达均下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）;与对照组和Hcy-L组相比，Hcy-M组和Hcy-H组DNMT3b蛋白表达均下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。HPLC检测结果显示:与对照组和Hcy-L组相比，Hcy-M组和Hcy-H组SAH的水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）;与对照组和Hcy-L组相比，Hcy-M组和Hcy-H组SAM/SAH比值降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。 腹腔注射及造模成功后Morris水迷宫实验显示，与MCAO组相比，MCAO+Hcy组大鼠逃避潜伏期明显缩短，差异均有统计学意义(P＜0.05);与MCAO组相比，及MCAO+Hcy组单位时间内穿越平台区域次数明显减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。DNA总甲基化水平检测结果显示:与MCAO组相比，MCAO+Hcy组总甲基化水平下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)。经免疫组化及Western blot检测:与MCAO组相比，MCAO+Hcy组Sox2蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。DNMTs总活性检测结果显示:与MCAO组相比，MCAO+Hcy组Sox2蛋白表达降低DNMTs活性下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)。Western blot结果显示:与MCAO组相比，MCAO+Hcy组DNMT1、DNMT3a蛋白表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。经HPLC检测显示，与SO组及MCAO组相比，MCAO+Hcy组Hcy浓度下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）;与SO组及MCAO组相比，MCAO+Hcy组SAM/SAH比值下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)。免疫荧光染色结果显示，Sox2呈阳性表达，且MCAO+Hcy组表达较SO组及MCAO组降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。 结论 本实验成功的分离培养大鼠新生鼠NSCs以及建立大鼠大脑中动脉栓塞模型。Hcy抑制NSCs的增殖其机制可能是:Hcy通过改变甲基化途径中关键代谢物SAH的浓度，降低SAM/SAH的比值，同时降低甲基化转移酶的活性及蛋白的表达，抑制了甲基化反应的发生，进而抑制了NSCs的增殖。