论文部分内容阅读
第一部分胆管癌组织中Lnc-ATB/miR-200c的表达及临床意义目的:研究Lnc-ATB与miR-200c在胆管癌组织中的表达及相关性,初步探讨其临床意义。方法:应用q RT-PCR方法检测Lnc-ATB及miR-200(miR-200a/b/c)在30例胆管癌组织及相应非癌组织中的表达。对两者表达量进行相关性分析,并结合患者的临床病理资料分析其临床意义。结果:通过比较30例胆管癌患者肿瘤组织及其相应非癌组织中Lnc-ATB及miR-200a/b/c表达水平,发现胆管癌组织中Lnc-ATB表达升高(3.807±0.907 VS1.049±0.510,P<0.001),而miR-200a(2.260±0.899 VS 3.099±1.062,p<0.05),miR-200b(1.338±0.587 VS 2.268±0.510,P<0.001)及miR-200c(0.469±0.251 VS1.452±0.410,P<0.001)表达均降低,其中以miR-200c表达降低最为明显。相关性分析提示胆管癌组织中Lnc-ATB高表达与miR-200c低表达密切相关(P<0.01)。Lnc-ATB呈高表达的胆管癌患者肿瘤体积较大,容易合并淋巴结转移,TNM分期较晚。而miR-200c呈低表达的胆管癌患者容易合并淋巴结转移,具有较晚的TNM分期。结论:胆管癌组织中Lnc-ATB表达升高,miR-200c表达降低,两者表达呈负相关。Lnc-ATB可能在胆管癌中发挥癌基因作用,而miR-200c可能发挥抑癌基因作用。第二部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌细胞中表达及功能目的:通过体外实验探讨Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌细胞中的表达及生物学作用。方法:应用q RT-PCR方法检测胆管癌细胞系HUCCT1、RBE、TFK1、Huh-28和人支气管上皮细胞BEC中Lnc-ATB/miR-200c的表达。采用si RNA技术敲低HUCCT1和RBE细胞中的Lnc-ATB表达水平,用q RT-PCR方法检测Lnc-ATB及miR-200c表达水平的变化。将Hu CCT1细胞同时转染带有野生型或突变型psi CHECK2-Lnc-ATB结合位点的质粒与miR-200c模拟物。转染后48h用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行荧光素酶活性测定,结合生物信息学分析,初步确定Lnc-ATB与miR-200c的调控关系及结合位点。采用si RNA技术敲低HUCCT1和RBE细胞中Lnc-ATB的表达结合共转染miR200c抑制剂建立三组不同Lnc-ATB/miR200c表达水平的细胞。三组细胞分别为单纯敲低Lnc-ATB表达组(si RNA-Lnc-ATB组),si RNA-Lnc-ATB+共转染miR200c抑制剂组及阴性对照组,应用q RT-PCR方法检测各组细胞miR-200c表达水平变化。通过CCK8细胞增殖实验、流式细胞周期实验及细胞凋亡实验、Transwell试验分析Lnc-ATB/miR-200c信号轴对HUCCT1和RBE细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移能力的影响。结果:与正常BEC细胞相比,Lnc-ATB在HUCCT1、RBE、TFK1、Huh-28四种胆管癌细胞株中呈高表达,而miR-200c呈相对低表达,其中以HUCCT1、RBE细胞最为明显,因此选择HUCCT1、RBE细胞进行si RNA干扰实验。si RNA干扰实验显示敲低HUCCT1和RBE细胞中Lnc-ATB的表达可以提高miR-200c的表达水平,并且si RNA1干扰效果优于si RNA2,因此采用si RNA1序列进行后续试验。生物信息学分析表明,Lnc-ATB含有潜在的miR-200c结合位点,预测miR-200c为Lnc-ATB的靶基因。双荧光素酶报告分析表明,miR-200c模拟物可以明显抑制带有野生型miR-200c结合位点的psi CHECK2-Lnc-ATB的荧光素酶活性,而在带有突变型miR-200c结合位点的psi CHECK2-Lnc-ATB中没有观察到这种现象。应用si RNA-Lnc-ATB体外敲低HUCCT1和RBE细胞Lnc-ATB表达可以升高miR-200c的表达水平,从而导致细胞增殖活力以时间依赖性方式下降,并促进细胞凋亡及G0/G1期阻滞,抑制细胞的迁移能力。然而,当将miR-200c抑制剂共转染入细胞以降低miR-200c表达时,可以逆转si RNA-Lnc-ATB对胆管癌细胞增殖、凋亡、G0/G1期阻滞及迁移能力的抑制。结论:胆管癌细胞中Lnc-ATB表达升高,miR-200c表达降低,Lnc-ATB通过抑制miR-200c表达参与调控胆管癌细胞的生长及迁移过程。第三部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴调控胆管癌生长和迁移的分子机制目的:研究Lnc-ATB/miR-200c相关信号通路因子在胆管癌细胞中的表达,为后续进一步研究提供理论指导。方法:采用si RNA技术敲低HUCCT1和RBE细胞中Lnc-ATB的表达,结合共转染miR200c抑制剂建立三组不同Lnc-ATB/miR200c表达水平的细胞。三组细胞分别为单纯敲低Lnc-ATB表达组(si RNA-Lnc-ATB组),si RNA-Lnc-ATB+共转染miR200c抑制剂组及阴性对照组(NC组)。应用Western blotting检测三组细胞之间细胞周期相关蛋白CCND1/CDK2、细胞凋亡相关蛋白BCL-2/Caspase-3及EMT相关信号通路因子ZEB1/2及E-cadherin/N-cadherin的表达差异。结果:体外敲低HUCCT1细胞Lnc-ATB表达可以抑制CCND1/CDK2表达,升高Caspase-3表达,降低BCL-2表达,抑制ZEB1/2表达,上调E-cadherin表达并下调N-cadherin表达。而将miR-200c抑制剂共转染入HUCCT1细胞后可以抑制miR-200c表达上调,进而逆转上述分子蛋白的表达变化。结论:Lnc-ATB通过抑制miR-200c表达调控胆管癌细胞周期、凋亡及EMT相关信号通路因子的表达,从而促进胆管癌细胞的增殖及迁移。第四部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌体外移植瘤模型中的作用目的:研究Lnc-ATB/miR-200c信号轴对胆管癌细胞成瘤作用及体内相关信号通路因子表达的影响,初步探讨其是否可能作为胆管癌诊断及治疗的潜在分子靶标。方法:设计包装携带有lentivirus-RNAi-Lnc-ATB,miR-200c抑制剂及阴性对照(negative control)的慢病毒,先利用该病毒感染HUCCT1细胞系,得到长期稳定表达的三组细胞,分别为单纯敲低Lnc-ATB表达组,敲低Lnc-ATB表达+共转染miR-200c抑制剂组及阴性对照组(NC组)。采用5周BALB/c裸鼠,随机分为三组,每组5只,分别取符合条件的三组HUCCT1细胞悬液建立裸鼠皮下移植瘤模型,连续饲养观察3周,每隔3天观察并记录期间肿瘤体积变化。待饲养3周后将裸鼠处死,比较肿瘤体积大小。采用免疫组织化学方法分析细胞增殖标志物PCNA在三组裸鼠肿瘤组织中的表达水平。利用Western blotting检测三组裸鼠肿瘤组织中细胞周期相关蛋白CCND1/CDK2、细胞凋亡相关蛋白BCL-2/Caspase-3及EMT相关信号通路因子ZEB1/2及E-cadherin/N-cadherin的表达差异。结果:采用慢病毒转染技术敲低HUCCT1细胞Lnc-ATB表达构建的裸鼠皮下移植瘤组织体积较小并伴有PCNA表达降低,而同时稳定转入miR-200c抑制剂的肿瘤细胞构建的裸鼠肿瘤组织体积及PCNA表达可以恢复。采用慢病毒转染技术敲低Lnc-ATB表达的HUCCT1细胞构建的裸鼠皮下移植瘤中的CCND1/CDK2及BCL-2表达降低,Caspase-3表达升高,ZEB1/2及N-cadherin表达降低,E-cadherin表达升高。而稳定转入si RNA-Lnc ATB+miR-200c抑制剂的肿瘤细胞构建的裸鼠移植瘤组织可以恢复其表达。结论:Lnc-ATB/miR-200c通过调控细胞周期、细胞凋亡及EMT相关信号通路因子表达促进胆管癌细胞的成瘤作用。Lnc-ATB/miR-200c或许可能成为胆管癌诊治的潜在分子靶标。