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第一部分二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化机制的体外研究背景:上皮细胞向间充质细胞转化即上皮间充质转化(EMT)是肾脏疾病进展的一个重要过程。转化生长因子β1(TGF-β1)是一种常见的促纤维化细胞因子,TGF-β1/整合蛋白联接激酶(ILK)信号通路和整合素β1(integrinβ1)/ILK信号通路在肾纤维化过程中对间质的慢性炎症变化和细胞外基质的积累起着重要作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)可下调肾小管上皮细胞分泌炎性介质ILK活性,延缓EMT。多个研究证实mi RNAs参与了肾小管水平细胞发育,如mi R-4756,mi R-34a和mi R-210。微眼相关转录因子(MITF)是MIR-541的靶点,MITF/mi R-541轴是心肌肥厚的一种新的调节途径。肿瘤转移和EMT的重要调节因子mi RNAs通过调节EMT相关基因参与各种肿瘤的进展。那么,mi R-541是否参与肾小管上皮细胞间质转化及纤维化的尚不清楚。二十碳五烯酸(EPA)具有降低蛋白尿、减轻肾脏损害、延缓肾脏进展等作用,然而EPA的肾脏保护作用是否通过TGF-β1/ILK信号通路和或integrinβ1/ILK信号通路、是否有mi R-541参与尚不清楚。目的:本研究对HK-2模型采用人血白蛋白(Alb)刺激,并对体内肾小管上皮细胞在发生蛋白尿后的病理改变过程进行模拟。分析EPA对肾脏EMT、纤维化和信号通路相关蛋白表达水平的影响,评价mi R-541在此过程的作用,并探讨其潜在机制。基于此,本体外实验研究将探讨EPA抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化中的可能作用机制,以期为临床治疗提供理论依据。方法:常规培养对数生长期HK-2细胞,对其进行培养24h后,将其放置在无血清培养24h,将细胞培养为G0期。(1)将5.0mg/ml Alb加入为白蛋白组(模型组);将EPAl0μmol/l+5.0mg/ml Alb(低剂量EPA干预组),EPA30μmol/l+5.0mg/ml Alb(高剂量EPA干预组),另外设置正常对照组。对以上各组进行培养24h、48h、72h,并对其具体指标进行测定。(2)细胞转染mi R-541抑制剂或mi R-NC抑制剂24h后,洗涤细胞,然后用或不用5mg/ml Alb处理,有或没有30μmol/l EPA刺激24h,对具体指标进行测定。各实验组均设置6个重复孔。(3)采用MTT法测定Alb或EPA对HK-2细胞活力的影响。通过QPCR检测ILK、integrinβ1、PPARγ、mi R-541、平滑肌肌动蛋白(a-SMA)、E钙黏蛋白(E-Cadherin)、I型胶原蛋白(collagen I)、纤维连接蛋白(FN)等m RNA表达。(4)采用Western blot法测定ILK通路相关蛋白TGF-β1、p Smad2/3、Smad7和ILK蛋白水平,同时测定integrinβ1、PPARγ、mi R-541、a-SMA、E-Cadherin、collagen I等蛋白水平。采用ELISA法检测FN的水平。(5)mi R-541和TGF-β1之间的目标关系通过生物信息学,荧光素酶基因测定和蛋白质印迹分析证实。结果:(1)低剂量的Alb对HK-2细胞的细胞存活率没有影响,而EPA以浓度依赖性方式抑制HK-2细胞的细胞活力。(2)HK-2在Alb的作用下,ILKm RNA和蛋白的表达上调,而integrinβ1、PPARγ的m RNA和蛋白的表达下调,EPA一定程度上抑制了该过程,且呈浓度和时间依赖性。(3)EPA可抑制Alb诱导的HK-2细胞的EMT和纤维化,并增加mi R-541表达。mi R-541的引入有效地消除了Alb刺激的HK-2细胞的EMT和纤维化。(4)生物信息学分析预测TGF-β1作为mi R-541的靶基因,随后荧光素酶报告基因检测和蛋白质印迹分析进一步支持了该预测。mi R-541可下调TGF-β1的表达,并抑制TGF-β1/Smad3/ILK通路。Alb处理激活TGF-β1/Smad3/ILK途径,而EPA抑制该途径的激活。(5)mi R-541抑制剂逆转了EPA对Alb诱导的HK-2细胞的EMT、纤维化和TGF-β1/Smad3/ILK通路相关蛋白表达的影响。结论:EPA可通过PPARγ介导的ILK/integrinβl信号通路直接激活核受体,或靶向mi R-541通过TGF-β1/Smads/ILK通路,抑制EMT和肾纤维化。第二部分二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化机制的体内研究背景:在慢性肾脏疾病中辅助采用二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等n-3多不饱和脂肪酸可使患者受益,比如降低蛋白尿、减轻肾脏损害、延缓肾脏进展等作用,然而具体作用机制尚不清楚。目的:本研究拟对早期阶段的2型糖尿病肾病KK-Ay/Ta小鼠采用EPA干预,通过检测小鼠表型变化、分析肾脏病理变化等,探讨体内试验研究中EPA抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化的机制,为EPA治疗慢性肾脏病尤其是早期糖尿病性肾病提供理论依据。方法:在本次体内实验中,将20只KK-Ay/Ta雄性小鼠采用随机数字表法进行分组分为2组每组均为10只雄性小鼠,其中治疗组从小鼠周龄自第12周开始给予EPA给药,每次腹腔内注射EPA1g/kg/d,连续注射8周,非治疗组在自第12周开始给予腹腔内注射生理盐水1g/kg/d,连续注射8周。对照组小鼠为10只Balb/c A雄性小鼠。分别在小鼠12周、16周及20周时对小鼠血压、血糖、尿蛋白肌酐比值等表型变化进行检测,并在小鼠20周龄时对血清脂肪酸、甘油三酯、胆固醇、晚期氧化蛋白产物(AOPP)、丙二醛(MDA)、胰岛素、糖耐量水平进行检测。对KK-Ay/Ta雄性小鼠进行8周治疗后处死,将肾组织取出,并采取形态学对肾组织进行观察及检测,采用图象分析软件、免疫组化对肾脏中TGFβ1、α-SMA、I型胶原、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等表达及巨噬细胞浸润的情况进行检测分析。同时采用RT-PCR检测MCP-1、TGFβl、α-SMA和I型胶原m RNA表达。结果:对KK-Ay/Ta雄性小鼠经EPA治疗后,相比于未治疗组,血清磷脂中EPA水平呈明显升高趋势,本研究结果提示腹腔内注射EPA被KK-Ay/Ta雄性小鼠充分吸收。经过EPA治疗后,KK-Ay/Ta雄性小鼠的AOPP、MDA水平明显得到降低,且KK-Ay/Ta雄性小鼠的血清甘油三酯下降明显,对尿白蛋白的排泄率起到明显降低作用,对葡萄糖不耐受现象明显得到改善。通过免疫组化检测及形态学检查均证实对KK-Ay/Ta雄性小鼠进行EPA治疗后可明显降低肾小球细胞外基质的积聚,同时可减少EMT和小管间质纤维化程度,另外可有效减弱肾脏中MCP-1及巨噬细胞的浸润。通过RT-PCR检测结果提示,对KK-Ay/Ta雄性小鼠进行EPA治疗后,与未治疗组相比,MCP-1、TGFβl、α-SMA及I型胶原m RNA表达均呈下降状态。结论:EPA可通过抑制肾脏局部的炎症、纠正体内异常代谢、调节TGFβ1水平和氧化应激状态等有效地缓解细胞外基质的积聚,减轻EMT和肾间质纤维化。