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马铃薯(Solanum tuberosum L.)作为直接供人类食用的第三大粮食作物，为全球粮食安全提供了保障。由于马铃薯具有适应性强、产量高和营养丰富均衡的特点，在保障我国粮食的稳步增长方面至关重要。淀粉作为马铃薯叶片的主要光合产物和块茎干物质的主要成分，其代谢过程的调控对马铃薯产量和品质形成都起着关键作用，同时淀粉也是低温糖化过程中还原糖累积的源头。虽然马铃薯淀粉代谢相关的部分酶的功能得到了鉴定，但是这些淀粉代谢基因的表达是否具有协同性以及其转录调控机制还知之甚少。前人研究表明马铃薯SnRK1在淀粉糖代谢过程中发挥着重要作用，但是其上游激酶在马铃薯中还未被鉴定；同时本实验室前期研究发现受低温诱导的β淀粉酶StBAM1和StBAM9参与到马铃薯块茎低温糖化过程，但它们在块茎中的低温诱导机制也还不明确。在此基础上，本课题对马铃薯SnRK1上游激酶进行鉴定和功能研究，同时对StBAM1和StBAM9在块茎中的低温诱导表达机制进行了解析。主要结果如下：
1.马铃薯SnRK1上游激酶的鉴定和功能研究
通过利用模式植物拟南芥SnRK1上游激酶GRIK1和GRIK2的序列信息，对马铃薯中StGRIKs进行了鉴定和分析，结果表明马铃薯基因组存在两个GRIKs同源基因，分别命名为StGRIK1和StGRIK2。通过克隆测序分析发现，StGRIK2存在多种可变剪接形式，且均不具有编码活性激酶的潜能；而StGRIK1能编码保守的GRIK蛋白，并具有体外激酶活性，还能直接在体外磷酸化StSnRK1α，表明StGRIK1可能是马铃薯中SnRK1上游唯一的激酶。共定位分析结果显示，StGRIK1定位于液泡膜，通过序列分析发现StGRIK1不含跨膜结构域，却在氨基端存在3个潜在的酰基化的半胱氨酸位点。随后对StGRIK1的截短和突变体定位分析发现，StGRIK1氨基端的3个酰基化半胱氨酸位点对于其液泡膜定位是必须的，但是包含这3个酰基化半胱氨酸位点的StGRIK1氨基端并不能定位于液泡膜；而进一步对StGRIK1互作蛋白的筛选与验证发现，StGRIK1能与囊泡运输相关蛋白StVAP1互作于液泡膜附近并呈现聚集状，暗示StVAP1可能协助StGRIK1通过囊泡运输途径转运至液泡膜。抑制StGRIK1的表达导致光照后马铃薯叶片淀粉和还原糖的含量及SnRK1内源的磷酸化水平均降低，进一步对StGRIK1干涉株系的转录组分析结果表明，多个淀粉代谢基因的表达受到影响，暗示StGRIK1可能通过磷酸化SnRK1而影响马铃薯叶片淀粉代谢基因的表达，从而调控马铃薯叶片淀粉糖代谢，最终影响马铃薯产量。
抑制StGRIK1的表达能增强马铃薯对盐胁迫的敏感性并加速黑暗诱导的叶片衰老过程。前人的研究显示盐胁迫和叶片衰老间存在交互，盐胁迫能刺激许多衰老相关基因的表达从而诱导衰老，并且它们能共同激活ROS途径。通过BiFC分析表明，StGRIK1-StABI2-StSOS2在马铃薯液泡膜上形成蛋白质复合体，而SOS2是盐胁迫响应途径中的关键因子，同时ROS相关的CAT2和NDPK2是StGRIK1潜在互作蛋白，在拟南芥中CAT2和NDPK2与SOS2也存在互作，暗示马铃薯中可能存在StGRIK1-StABI2-StSOS2-StCAT2-StNDPK2复合体介导马铃薯对盐胁迫和衰老的响应。
此外，StGRIK1在花芽和花中特异高表达，抑制StGRIK1后马铃薯不能在长日照成花，表明StGRIK1在马铃薯成花和花发育过程中起着关键作用。
2.马铃薯β淀粉酶StBAM1和StBAM9的在块茎中的低温诱导机制解析
通过对StBAM1和StBAM9的启动子区域的克隆和序列分析及StBAM1和StBAM9的表达模式分析发现，它们的启动子上均含有ABA响应元件(ABRE)，同时其表达也受到ABA的诱导，暗示StBAM1和StBAM9可能受到ABA信号途径中能识别ABRE的AREB/ABF/ABI5类转录因子的直接调控。通过全基因组范围内的序列鉴定和分析发现，马铃薯基因组中有7个AREB/ABF/ABI5亚家族成员。亚细胞定位、酵母转录活性和表达模式分析显示，马铃薯AREB/ABF/ABI5s均为核蛋白，StAREB1、StAREB2和StAREB4同时具有转录活性和ABA诱导性，表明这些基因可能是介导ABA信号途径的核心转录因子。体外ABRE结合活性分析和体内对StBAM1和StBAM9的启动子激活分析结果表明，马铃薯AREB/ABF/ABI5s均能识别并结合ABRE，只有StAREB2、StAREB3、StAREB4和StABL2能同时激活StBAM1和StBAM9的启动子活性，暗示这些成员可能直接调控StBAM1和StBAM9的表达。对低温贮藏块茎的ABA含量测定和ABA合成过程中StNCED1的表达分析结果显示，低温可能通过诱导StNCED1的表达而促进ABA含量的累积。最后通过对块茎贮藏过程中马铃薯AREB/ABF/ABI5亚家族成员与StBAM1和StBAM9的表达模式分析发现，在块茎低温贮藏过程中StAREB2与StBAM1和StBAM9具有相似的表达模式。由此说明，马铃薯块茎在低温贮藏的过程中，低温可能通过诱导StNCED1的表达而导致ABA的累积，随后激活ABA下游的转录因子StAREB2，StAREB2能识别并结合StBAM1和StBAM9上的ABRE而激活其转录，最终促进淀粉降解和还原糖的累积。
1.马铃薯SnRK1上游激酶的鉴定和功能研究
通过利用模式植物拟南芥SnRK1上游激酶GRIK1和GRIK2的序列信息，对马铃薯中StGRIKs进行了鉴定和分析，结果表明马铃薯基因组存在两个GRIKs同源基因，分别命名为StGRIK1和StGRIK2。通过克隆测序分析发现，StGRIK2存在多种可变剪接形式，且均不具有编码活性激酶的潜能；而StGRIK1能编码保守的GRIK蛋白，并具有体外激酶活性，还能直接在体外磷酸化StSnRK1α，表明StGRIK1可能是马铃薯中SnRK1上游唯一的激酶。共定位分析结果显示，StGRIK1定位于液泡膜，通过序列分析发现StGRIK1不含跨膜结构域，却在氨基端存在3个潜在的酰基化的半胱氨酸位点。随后对StGRIK1的截短和突变体定位分析发现，StGRIK1氨基端的3个酰基化半胱氨酸位点对于其液泡膜定位是必须的，但是包含这3个酰基化半胱氨酸位点的StGRIK1氨基端并不能定位于液泡膜；而进一步对StGRIK1互作蛋白的筛选与验证发现，StGRIK1能与囊泡运输相关蛋白StVAP1互作于液泡膜附近并呈现聚集状，暗示StVAP1可能协助StGRIK1通过囊泡运输途径转运至液泡膜。抑制StGRIK1的表达导致光照后马铃薯叶片淀粉和还原糖的含量及SnRK1内源的磷酸化水平均降低，进一步对StGRIK1干涉株系的转录组分析结果表明，多个淀粉代谢基因的表达受到影响，暗示StGRIK1可能通过磷酸化SnRK1而影响马铃薯叶片淀粉代谢基因的表达，从而调控马铃薯叶片淀粉糖代谢，最终影响马铃薯产量。
抑制StGRIK1的表达能增强马铃薯对盐胁迫的敏感性并加速黑暗诱导的叶片衰老过程。前人的研究显示盐胁迫和叶片衰老间存在交互，盐胁迫能刺激许多衰老相关基因的表达从而诱导衰老，并且它们能共同激活ROS途径。通过BiFC分析表明，StGRIK1-StABI2-StSOS2在马铃薯液泡膜上形成蛋白质复合体，而SOS2是盐胁迫响应途径中的关键因子，同时ROS相关的CAT2和NDPK2是StGRIK1潜在互作蛋白，在拟南芥中CAT2和NDPK2与SOS2也存在互作，暗示马铃薯中可能存在StGRIK1-StABI2-StSOS2-StCAT2-StNDPK2复合体介导马铃薯对盐胁迫和衰老的响应。
此外，StGRIK1在花芽和花中特异高表达，抑制StGRIK1后马铃薯不能在长日照成花，表明StGRIK1在马铃薯成花和花发育过程中起着关键作用。
2.马铃薯β淀粉酶StBAM1和StBAM9的在块茎中的低温诱导机制解析
通过对StBAM1和StBAM9的启动子区域的克隆和序列分析及StBAM1和StBAM9的表达模式分析发现，它们的启动子上均含有ABA响应元件(ABRE)，同时其表达也受到ABA的诱导，暗示StBAM1和StBAM9可能受到ABA信号途径中能识别ABRE的AREB/ABF/ABI5类转录因子的直接调控。通过全基因组范围内的序列鉴定和分析发现，马铃薯基因组中有7个AREB/ABF/ABI5亚家族成员。亚细胞定位、酵母转录活性和表达模式分析显示，马铃薯AREB/ABF/ABI5s均为核蛋白，StAREB1、StAREB2和StAREB4同时具有转录活性和ABA诱导性，表明这些基因可能是介导ABA信号途径的核心转录因子。体外ABRE结合活性分析和体内对StBAM1和StBAM9的启动子激活分析结果表明，马铃薯AREB/ABF/ABI5s均能识别并结合ABRE，只有StAREB2、StAREB3、StAREB4和StABL2能同时激活StBAM1和StBAM9的启动子活性，暗示这些成员可能直接调控StBAM1和StBAM9的表达。对低温贮藏块茎的ABA含量测定和ABA合成过程中StNCED1的表达分析结果显示，低温可能通过诱导StNCED1的表达而促进ABA含量的累积。最后通过对块茎贮藏过程中马铃薯AREB/ABF/ABI5亚家族成员与StBAM1和StBAM9的表达模式分析发现，在块茎低温贮藏过程中StAREB2与StBAM1和StBAM9具有相似的表达模式。由此说明，马铃薯块茎在低温贮藏的过程中，低温可能通过诱导StNCED1的表达而导致ABA的累积，随后激活ABA下游的转录因子StAREB2，StAREB2能识别并结合StBAM1和StBAM9上的ABRE而激活其转录，最终促进淀粉降解和还原糖的累积。