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目的: 胃癌是世界范围内最常发生的恶性肿瘤之一,在亚洲国家是肿瘤死亡的主要原因。多数患者在诊断时已经是进展期或发生转移,5年生存率只有10%-15%。化疗是治疗晚期胃癌的主要手段。尽管化疗药物的应用使晚期病人的生存期有所延长,但中位总生存时间很难超过12个月。近年来兴起的靶向治疗使个体化治疗成为可能,明显提高了肿瘤治疗的疗效。靶向治疗是建立在对基因、受体认识的基础上发展起来的新的治疗领域,具有十分广阔的前景。其中针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor EGFR)的治疗成为目前肿瘤治疗研究的热点之一。 表皮生长因子受体(EGFR)家族是跨膜的受体型酪氨酸激酶中最具有代表性的分子之一。据有广泛的生物学功能,在细胞生长、增殖和分化的过程中具有重要作用。研究表明,在乳腺癌、大肠癌、肺癌、头颈部鳞癌等多种上皮细胞来源的肿瘤中存在EGFR基因的异常活化、扩增以及过度表达。Cetuximab(C225)是EGFR的单克隆抗体,在结直肠癌,非小细胞肺癌及头颈部肿瘤中与化疗联合取得了很好的疗效。因此,研究C225对胃癌细胞增殖的影响及其作用机制可为胃癌的治疗提供理论依据。 磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)/Akt信号转导通路和细丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)在维持细胞生存和抑制细胞凋亡中起关键作用,近年来发现与人类肿瘤的发生发展密切相关。但PI3K/Akt和MAPK/ERK通路在C225抑制胃癌细胞增殖和诱导胃癌细胞凋亡中的作用目前尚未见报道。 Cbl家族蛋白(Cb-b和c-Cbl)是一种高度保守的RING家族E3泛素连接酶,在生长因子的信号转导及调控方面发挥着重要作用。研究表明它能通过特异性地选择底物蛋白启动泛素化降解途径而参与细胞内信号转导的负向调控。目前越来越多的证据表明E3泛素连接酶Cbl-b(Casitas B lineage lymphoma-b)在诱导T细胞CD3的细胞凋亡中起重要作用,但关于Cbl蛋白在C225诱导的胃癌细胞凋亡中的作用机制不清楚。 本课题以胃癌细胞株MGC803,BGC823,SGC7901为模型,初步观察了C225对胃癌细胞增殖和凋亡的影响,并对PI3K/Akt和MAPK/ERK通路及其上游分子泛素连接酶Cbl家族蛋白在此过程中的调控机制进行了探讨。 材料与方法: 1.采用MTT法测定细胞活力,绘制增殖曲线。 2.采用流式细胞仪通过PI染色进行细胞凋亡判定。 3.采用Western blot检测ERK,P-ERK,Akt,P-Akt,Cbl-b蛋白的表达。 4.采用Lipofectamine2000试剂进行稳定转染。 5.统计学处理:每次实验重复3次,数据以(x)±s表示,两组间差异采用Student'st test分析。P<0.05有统计学意义。 实验结果: 1.EGF以时间依赖性方式促进MGC803,BGC823,SGC7901细胞增殖。以0.5ng/mlEGF处理MGC803,BGC823,SGC7901细胞72h,细胞的增殖比率分别是对照组的482%,450%,232%。以0.1μg/mlC225作用于EGF预处理的MGC803,BGC823,SGC7901细胞72h,C225可部分抑制EGF诱导的MGC803,BGC823,SGC7901细胞增殖,抑制率分别为12%,15%,17%。 2.流式细胞仪分析显示0.1μg/ml的C225诱导不超过25%的细胞凋亡。C225作用于胃癌MGC803,BGC823细胞24h后,分别诱导21.54±2.42%,10.24±3.24%的细胞凋亡。 3.EGF以时间依赖方式上调p-ERK的表达。0.5ng/mlEGF作用于MGC803细胞24h,p-ERK的表达水平是对照组的3.46倍。以0.1ug/mlC225预处理4h,再0.5ng/mlEGF处理,EGF引起的ERK磷酸化水平降低,提示C225部分抑制了EGF引起MAPK/ERK通路活化。 4.EGF以时间依赖方式上调p-Akt的表达。0.5ng/mlEGF作用于MGC803细胞24h,p-Akt的表达水平是对照组的3.12倍。以0.1ug/mlC225预处理4h,再以0.5ng/mlEGF处理,EGF引起的Akt磷酸化水平降低,提示C225部分抑制了EGF引起的PI3K/Akt通路活化。 5.0.5ng/mlEGF作用于MGC803细胞24h,Western blot结果显示Cbl-b表达水平下调(是对照组的0.85倍),0.1ug/mlC225处理24h,Western blot结果显示Cbl-b表达水平明显上调(是对照组的2.78倍)。 6.0.1 ug/mlC225作用于MGC803细胞24h,Western blot结果显示,C225能上调Cbl-b的表达,进一步检测Cbl-b的下游分子Akt,发现p-Akt表达下调,且p-Akt表达的下调与Cbl-b表达的上调同时发生。用蛋白酶体通路抑制剂硼替佐米(Ps341)抑制泛素连接酶Cbl的功能,结果显示,以10nMPs341预处理MGC803细胞4h,再以C225作用于胃癌细胞MGC803,继续培养24h后细胞凋亡较单纯C225组明显减少,同时Western blot结果显示Ps341部分逆转了C225下调p-Akt表达的作用。 7.使用Lipo2000稳定转染野生型Cbl-b的表达载体进入MGC803细胞,转染成功后用Western blot的方法证实Cbl-b的表达量提高。与阴性对照相比,在Cbl-b转染的细胞中,C225诱导的胃癌细胞凋亡被部分逆转。 结论: 1.C225能抑制EGF作用下胃癌细胞系MGC803,BGC823,SGC7901细胞增殖及诱导凋亡。 2.C225在促进胃癌细胞MGC803凋亡过程中下调了p-Akt和p-ERK的表达。提示PI3K/Akt和MAPK/ERK通路可能是C225促进胃癌细胞凋亡的机制之一。 3.C225在诱导胃癌细胞MGC803凋亡的过程中,上调了Cbl-b的表达,同时下调了p-Akt的表达。用PS-341抑制Cbl蛋白的功能能部分逆转Akt的活性和C225诱导胃癌细胞凋亡的作用。