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研究背景肝细胞癌是全球第6位、也是我国第4位常见恶性肿瘤。它起病隐匿,进展迅速,首诊时多为晚期且肿瘤异质性强,治疗后极易复发转移等一系列原因导致目前肝细胞癌患者的总体预后依然较差。因此,寻找新的诊断标志物,深入探索肝细胞癌发生发展与复发转移的机制,发掘新的干预靶标与治疗手段对于改善肝细胞癌患者的预后意义重大。α-甲胎蛋白是目前临床上最常用的肝细胞癌诊断标志物,但其最大的缺点是敏感度低。外泌体是一种直径约为40-160 nm的细胞外囊泡,它具有较高的稳定性,是一种新兴的、微创的液体活检工具。最近研究表明,在胃癌、肺癌与膀胱癌的诊断中,部分循环外泌体lncRNA的诊断价值优于传统生物标志物,因此,循环外泌体作为诊断标志物也许是可行的。但目前在肝细胞癌中此类研究仍然较少,因此有必要进一步明确循环外泌体lncRNA在肝细胞癌中的诊断价值。本研究的第一部分主要通过新一代测序技术、q RT-PCR技术探索外周血液循环中可用于肝细胞癌诊断的外泌体lncRNA。大量研究已经证实lncRNA在肝细胞癌的发生发展、复发转移中存在广泛失调且发挥重要调控作用。随着对lncRNA机制研究的不断深入,越来越多lncRNA被发现在肝癌转录调控、染色质修饰、转录后调节等方面有着举足轻重的地位,是肝癌治疗的潜在靶分子。超过70%的人类基因组都转录成了非编码RNA,这其中4%-9%的人类基因组都将转录成lncRNA,由此可见lncRNA数量之庞大,但目前仅有少部分lncRNA的功能被完整阐释,绝大部分lncRNA的功能与作用机制仍不明确。本研究的第二部分主要阐释我们在第一部分研究中所发现的新lncRNA分子THEMIS2-211在肝细胞癌中的功能,而第三部分则进一步揭示lncRNA THEMIS2-211在肝细胞癌中发挥功能的作用机制。第一部分肝细胞癌中循环外泌体lncRNA的诊断价值研究目的:寻找有价值的循环外泌体lncRNA用于诊断肝细胞癌（HCC）。研究方法:通过新一代测序技术筛选肝细胞癌患者与正常对照者血浆外泌体中差异表达的lncRNA,利用q RT-PCR在训练组与验证组中进一步验证,后通过受试者工作特征曲线下面积（AUC）来评估循环外泌体lncRNA诊断肝细胞癌的价值。研究结果:与正常对照者相比,肝细胞癌患者血浆外泌体中存在1446个下调的lncRNAs（Fold Change≤0.5）与305个上调的lncRNAs（Fold Change≥2）,其中有5个下调的lncRNAs与4个上调lncRNAs分子具有显著差异（Fold Change≤0.5 or≥2且p＜0.05）。q RT-PCR验证外泌体lncRNA H19-204、THEMIS2-211与PRKACA-202在肝细胞癌患者中表达上调（p＜0.05）且在循环中稳定存在。在训练组中,外泌体中lncRNA H19-204、THEMIS2-211、PRKACA-202及α-甲胎蛋白区分肝细胞癌患者与正常对照者的AUC曲线下面积分别为0.701、0.832、0.804及0.838。在验证组中,外泌体中lncRNA H19-204、THEMIS2-211、PRKACA-202及α-甲胎蛋白区分肝细胞癌患者与正常对照者的AUC曲线下面积分别为0.67、0.816、0.812及0.824。通过把外泌体lncRNA两两联合比较后构建了基于外泌体lncRNA THEMIS2-211与lncRNA PRKACA-202的最优诊断组合,在验证队列中诊断肝细胞癌的AUC为0.881,其诊断价值不劣于外泌体lncRNA H19-204+THEMIS2-211+PRKACA-202（AUC=0.887）且优于α-甲胎蛋白（AUC=0.824）。肝癌细胞分泌的外泌体中lncRNA THEMIS2-211与PRKACA-202含量均显著高于正常肝细胞（p＜0.05）。在HCC患者循环中外泌体lncRNA THEMIS2-211的高表达与更大的肿瘤直径（≥5cm）（p=0.014）及更晚的TNM分期（Ⅲ+Ⅳ）（p=0.006）相关,而外泌体lncRNA PRKACA-202的高表达与更晚的TNM分期相关（Ⅲ+Ⅳ）（p=0.001）。结论:循环外泌体lncRNA THEMIS2-211与lncRNA PRKACA-202是肝细胞癌的潜在生物标志物。第二部分LncRNA THEMIS2-211在肝细胞癌中的功能研究目的:阐明lncRNA THEMIS2-211在肝细胞癌中的功能。研究方法:利用慢病毒在肝癌细胞中敲低与过表达lncRNA THEMIS2-211后,采用CCK-8法检测细胞增殖能力、划痕实验与transwell迁移实验检测细胞迁移能力、transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力、q RT-PCR及Western blotting检测EMT相关蛋白标志物改变情况及裸鼠皮下移植瘤动物实验评估成瘤大小。研究结果:LncRNA THEMIS2-211在肝癌患者癌组织中的表达显著高于配对的癌旁组织,且其表达水平与肿瘤大小及TNM分期呈正相关。LncRNA THEMIS2-211在4个肝癌细胞系中的表达量均显著高于正常肝细胞系（p＜0.05）。在肝癌细胞中敲低lncRNA THEMIS2-211后,CCK-8实验示其增殖能力下降,划痕实验与transwell迁移实验示其迁移能力下降,transwell侵袭实验示其侵袭能力下降;过表达反之。在肝癌细胞中敲低lncRNA THEMIS2-211后E-cadherin在m RNA和蛋白水平的表达量均上调,而N-cadherin与vimentin在m RNA和蛋白水平的表达量均下调;过表达反之。体内动物实验示:在肝癌细胞中敲低lncRNA THEMIS2-211后皮下移植瘤成瘤体积与重量均小于对照组（p＜0.05）;敲低lncRNA THEMIS2-211后Ki67平均阳性染色面积显著低于对照组（p＜0.05）。结论:在肝细胞癌中,lncRNA THEMIS2-211具有促癌作用。第三部分LncRNA THEMIS2-211促进肝癌细胞增殖、迁移与侵袭的机制研究研究目的:阐明lncRNA THEMIS2-211在肝细胞癌中发挥功能的作用机制。研究方法:利用荧光原位杂交实验检测lncRNA THEMIS2-211在肝癌细胞中的亚细胞定位,RNA pull-down实验探索可能与lncRNA THEMIS2-211相互作用胞质蛋白。生物信息学方法预测可能与lncRNA THEMIS2-211相结合的mi RNA及可能互为内源性竞争性RNA的m RNA,RIP实验、RNA pull-down实验及双荧光素酶报告基因实验验证它们间相互作用及靶向结合关系。挽救实验进一步验证lncRNA THEMIS2-211与mi RNA及靶基因间的相互关系。研究结果:荧光原位杂交实验示在肝癌细胞中lncRNA THEMIS2-211主要定位于细胞质。RNA pull-down实验未发现有胞质蛋白与lncRNA THEMIS2-211发生直接相互作用。经生物信息学预测、q RT-PCR、Western blotting及RIP实验验证SPOCK1为lncRNA THEMIS2-211的ce RNA分子且在肝癌组织中的表达与lncRNA THEMIS2-211呈正相关（r=0.8303,p=0.009）。RIP实验、RNA pull-down实验及双荧光素酶报告基因实验验证了lncRNA THEMIS2-211与mi R-940在功能上的相互作用及靶向结合关系。挽救实验进一步确认了lncRNA THEMIS2-211对SPOCK1的调控依赖于mi R-940且lncRNA THEMIS2-211依赖于mi R-940促进肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭。结论:LncRNA THEMIS2-211依赖于mi R-940调控SPOCK1进而促进肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭。