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目的: 胰岛素抵抗在2型糖尿病(T2D)的发生和发展中起着至关重要的作用。因此,寻找能够逆转胰岛素抵抗的药物是治疗这种疾病的根本途径。近年来,成纤维细胞生长因子(FGF)作为潜在的胰岛素增敏剂用来缓解T2D和相关的代谢紊乱。FGF4作为旁分泌FGFs家族的重要成员,在胚胎发育过程中发挥着多种重要的调控功能。有报道旁分泌FGF1作为胰岛素增敏剂可以降低糖尿病小鼠血糖。那么,同样作为旁分泌蛋白的FGF4是否有相同的作用呢?本次研究,我们从改善胰岛素抵抗的角度探索了FGF4对代谢性疾病的调控作用,并进一步证明FGF4改善胰岛素抵抗可能通过肝脏,脂肪组织和肌肉等器官发挥作用以及研究相关信号通路。为探索、研发新型的胰岛素增敏剂提供理论依据。 方法: ①蛋白表达和纯化:本研究使用美国纽约大学Moosa Mohammedi教授实验室提供的 FGF4 质粒,将质粒导入 BL21(DE3)大肠杆菌细胞,在 37℃恒温摇床培养约4h,然后加入诱导剂IPTG,低温过夜诱导,得到含有目的蛋白大肠杆菌菌体。将得到的大肠杆菌用匀浆机破碎,用AKTA pure设备将破碎得到的菌液依次通过肝素亲和柱和分子筛(Superdex-100),从而得到高纯度的目的蛋白FGF4。用12% SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白纯度,确定其纯度>98%。 ②临床抽选样本的检测:利用酶联免疫吸附测定技术(ELISA)分别测定11名正常人, 6名糖尿病病人血清中FGF1,FGF4,FGF7,FGF8,FGF20的含量。 ③Ⅱ型糖尿病模型:选取50只,10周龄,雄性db/db小鼠和20只同窝db/m小鼠,FGF4隔天腹腔给药(1.0 mg/kg),db/m和模型组注射相同量的0.9%生理盐水,连续给药5周,隔天监测血糖,摄食饮水和体重,在d28测ITT,d34测OGTT;选取20只,10周龄,雄性 ob/ob小鼠和10只同窝ob/m小鼠,FGF4隔天腹腔给药(1.0 mg/kg),ob/m和模型组注射相同量的0.9%生理盐水,连续给药5周,隔天监测血糖,摄食饮水和体重。 ④组织分析:收集各模型小鼠的血清,肝脏和脂肪组织。采用 western blotting,q-PCR,免疫组织化学,PAS 染色,油红 O染色等方法进行组织分析。 ⑤体外细胞实验:HL7702 细胞,使用含有 15% FBS的1640培养基进行培养,待细胞长至对数生长期,使用含1% FBS的1640饥饿培养基饥饿24h,分别加入FGF1和FGF4(10, 100, 500 ng/mL)孵育20min,采用western 印迹的方法检测相关信号蛋白的表达情况。 结果: 2型糖尿病人和小鼠血清中,FGF1,FGF4,FGF7的含量显著下降,并且与FGFR1有较强的亲和能力。在用FGF4处理的胰岛素抵抗小鼠(T2D小鼠db/db和ob/ob)均发现稳定的降糖作用,并且胰岛素耐量试验(ITT)和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)均显示,胰岛素抵抗有显著改善。HE染色,PAS染色,油红O染色和免疫组化的结果均显示FGF4对肝脏脂肪变性有明显的改善。体外细胞实验与动物实验结果一致,在HL-7702细胞中FGF4可以增加FRS2,PLCγ, PPARγ和IRS-1的磷酸化水平。 结论: 在这里,我们已经证明急性和慢性FGF4治疗可以增强T2D小鼠中的胰岛素的作用,可能通过上调肝脏,脂肪和肌肉组织中IRS-1和AKT的磷酸化水平发挥作用。此外,通过抑制脂质合成和积聚,FGF4对肝脂肪变性具有强大的治疗作用。此外,FGF4对肝脏的代谢改善主要由FGFR1及其下游信号PPARγ的激活介导。这些结果表明FGF4可以充当潜在的胰岛素增敏剂以缓解和T2D相关的代谢紊乱。