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Na+,K+/H+反向转运体(antiporters,NHXs)是一类跨膜反向转运蛋白,它们的生化活力是将Na+或K+与质子(H+)进行跨膜反向转运。植物Na+,K+/H+反向转运体在细胞离子平衡,pH调节,细胞生长,膜微囊运输,蛋白存储,渗透调节,逆境响应以及植物生长发育等生理生化过程中起着重要的作用。拟南芥Na+,K+/H+反向转运体基因家族包括8个成员,分为三类,即,质膜NHXs,液胞NHXs和内膜NHXs(endosomal NHXs)。目前,关于植物质膜NHXs和液胞NHXs已被广泛研究。AtNHX5和AtNHX6位于Golgi/TGN,属于内膜NHXs。目前对于AtNHX5和AtNHX6的生物功能还很不清楚。我们运用细胞,遗传和分子生物学技术方法,对拟南芥AtNHX5和AtNHX6的基因表达模式,亚细胞定位,离子转运特性以及在K+运输,pH调节和植物生长发育中的作用进行了研究,以期阐明拟南芥AtNHX5和AtNHX6在K+运输,pH调节和植物生长发育中的生物功能及作用机理。本研究取得以下研究成果:(1)为了分析AtNHX5和AtNHX6的生物功能,我们制备了nhxn nhx6双突变体。我们在筛选nhx5和nhx6单突变体的基础上,经过杂交得到nhxn nhx6双突变体。我们发现,nhx5nhx6双突变体生长迟缓,发育受阻,植株矮小,表明AtNHX5和AtNHX6具有调节植物生长发育的功能。为了进一步验证AtNHX5和AtNHX6基因的生物功能,我们制备了恢复系植株,将AtNHX5和AtNHX6基因分别表达在nhx5nhx6双突变体之中,发现AtNHX5和AtNHX6基因能够恢复nhx5 nhx6双突变体的生长。(2)Promoter-GUS研究发现,AtNHX5和AtNHX6主要在子叶,下胚轴和花中表达。拟南芥原生质体瞬时表达和转基因植物稳定表达实验发现,AtNHX5 和 AtNHX6 定位在 Golgi 和 TGN 上。(3)采用缺失离子转运蛋白的酵母突变体分析AtNHX5和AtNHX6的离子转运特性。发现AtNHX5和AtNHX6能够抵抗高浓度K+,Na+和潮霉素的胁迫,表明AtNHX5和AtNHX6具有K+和Na+离子运输功能,并且参与细胞膜微囊运输过程。实验还发现AtNHX5和AtNHX6介导的K+转运与AtCHXs所介导的K+转运可能具有不同的催化模式:AtNHX5和AtNHX6在高钾,酸性环境下起作用;AtCHXs则在低钾,碱性条件下发挥作用。(4)生长分析实验发现,nhx6双突变体在低钾处理下根系变短,钾含量降低;过表达AtNHX5和AtNHX6能够恢复nhx5 nhx6双突变体根系生长,表明AtNHX5和AtNHX6所介导的钾离子运输对植物的生长起着重要的作用。(5)通过与酵母ScNhxlp序列比对分析发现,AtNHX5和AtNHX6在跨膜区存在四个保守的酸性氨基酸位点,即AtNHX5上的D164,E188,D193和E320;AtNHX6上的D165,E189,D194和E320。酵母生长分析发现,其中三个酸性氨基酸进行点突变后(AtNHX5:D164N,E188Q和D193N;AtNHX6:D165N,E189Q和D194N)不能恢复高浓度K+和潮霉素对酵母突变体的胁迫作用。我们同时将这些点突变基因导入nhx5 nhx6双突变体,进行遗传恢复实验,发现这三个点突变也不能恢复nhx5 nhx6双突变体的生长表型。实验结果表明,这些保守的酸性氨基酸对于AtNHX5和AtNHX6的离子转运活力和植物的生长发育至关重要。(6)采用pH荧光探针BCECF和细胞汁液测定方法分析发现,nhx5 nh6双突变体液胞和细胞质的pH值降低,表明AtNHX5和AtNHX6调节细胞pH的动态平衡。总之,我们研究结果表明,AtNHX5和AtNHX6在调节细胞pH和K+的动态平衡中起着重要作用;AtNHX5和AtNHX6跨膜区的保守的酸性氨基酸对于离子转运活力和植物的生长发育至关重要。