二苯甲酮（Benzophenones,BPs）因具有良好的紫外吸收作用被广泛添加于防晒霜等个人护理产品。BP亲本结构由两个芳香环和一个羰基组成,在此基础上衍生出一系列化合物,包括4-羟基二苯甲酮（4-Hydroxybenzophenone,4HBP）和2-羟基-4-甲氧基BP（2-Hydroxy-4-methoxy-BP,BP-3）等。BP-3进入体内后亦可迅速代谢为4HBP。4HBP在人群样本中的检测率超过80%,包括孕妇和儿童等敏感人群。值得注意的是,4HBP已被证明可以穿过胎盘屏障,但对其孕期暴露的健康风险知之甚少。近期的出生队列研究发现,母亲4HBP的暴露水平与儿童神经认知发育呈显著负相关,然而其毒理效应和潜在的分子机制仍有待阐明。胎儿大脑通过复杂的发育过程,最终塑造为成熟大脑的功能结构。大脑高级功能,比如认知功能,主要在妊娠中期和幼儿期建立,其中神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）的增殖和分化发挥关键作用。目前已在胚胎脑的广泛区域和成年脑的一些特定区域内发现并分离出NSCs,主要之一就是与学习和记忆等高级功能密切相关的海马区。近年来研究表明,环境因素暴露可通过损伤NSCs功能,对神经发育产生持久的不良影响。内质网（Endoplasmic reticulum,ER）是真核细胞内蛋白质和脂类合成加工的场所,对环境刺激高度敏感。组织微环境改变会引起内质网稳态（如蛋白质稳态和氧化还原稳态）失衡,诱导内质网应激,激活未折叠蛋白响应（Unfolded protein response,UPR）。经典的UPR由三条信号通路组成,其中一个分支由蛋白激酶R样内质网激酶（Protein kinase R-like ER kinase,PERK）所引起,通过磷酸化真核翻译起始因子2的α亚基（α-subunit of eukaryotic initiation factor 2,eIF2α）,在暂时抑制m RNA整体翻译水平的同时启动个别m RNA的翻译,如转录激活因子4（ATF4,Activating transcription factor 4）。ATF4是重要的转录因子,一方面通过调控蛋白折叠、自噬等相关基因的表达促进适应性反应;另一方面,在持续性应激条件下激活C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）从而引发细胞凋亡。有研究报道,PERK通路的激活不仅能抑制神经元重要突触蛋白的翻译、促进神经退行性变,还能激活CHOP从而诱导神经元凋亡。因此,PERK-ATF4信号通路在神经系统疾病中发挥重要作用。基于上述背景和科学问题,本研究首先建立了胎鼠海马区原代NSCs以及孕鼠4HBP染毒模型,明确4HBP染毒对子代小鼠海马区NSCs功能和认知发育的毒性效应和剂量反应关系。其次,探索内质网应激PERK-ATF4信号介导4HBP海马区发育毒性的分子机制。最后,干预4HBP暴露激活的PERK-ATF4信号,在NSCs、孕鼠和人源类脑器官染毒模型中验证海马区发育损伤以及认知功能障碍的机制。第一部分4HBP孕期暴露损伤子代小鼠海马区NSCs功能和认知发育目的:通过建立胎鼠海马区原代NSCs以及孕鼠4HBP染毒模型,明确4HBP染毒对子代小鼠海马区NSCs功能和认知发育的影响。方法:（1）细胞实验:从E14.5胎鼠海马区分离原代NSCs,通过神经球动力学实验、CCK-8、免疫荧光染色、Western blot等方法观察体外4HBP染毒（0、1、10、102、103 n M）对NSCs活力、增殖和凋亡等功能的影响。（2）动物实验:对孕鼠给予4HBP浓度梯度(0、0.01、0.1、1 mg kg-1 day-1)暴露。将产后1天（Postnatal 1,P1）新生鼠在正常条件下饲养至产后56天（Postnatal 56,P56）进行水迷宫、T迷宫和避暗等行为学实验,观察认知功能改变。同时,使用液相色谱串联质谱法检测孕鼠血清、胎盘组织及新生鼠脑组织内的4HBP水平。此外,取P1和P56子代海马区组织,组织学染色观察海马区体积变化,免疫荧光染色以及Western blot技术检测海马区增殖和凋亡等相关蛋白的表达。结果:（1）体外4HBP染毒抑制NSCs的增殖与分化:1μM 4HBP显著抑制神经球直径、原代NSCs活力以及增殖,促进NSCs凋亡。此外,1μM 4HBP染毒显著降低了NSCs分化形成的神经元总树突长度、末端分支及形态复杂性,促进向星形胶质细胞的分化。（2）孕期4HBP暴露损害子代的认知功能:与对照组相比,水迷宫空间学习测试发现,孕期1 mg kg-1 day-1 4HBP暴露后子代寻找水下平台花费的时间显著降低;记忆测试发现,子代水下平台所在象限游泳的时间与穿过平台的次数显著降低。在T迷宫实验中,1 mg kg-1 day-1 4HBP暴露子代自发交替行为显著减少。在避暗实验中,1 mg kg-1 day-1 4HBP暴露子代在暗室中停留的时间显著增加。（3）孕期4HBP暴露损伤子代的海马区发育:组织学和免疫荧光染色发现,1 mg kg-1 day-14HBP暴露会导致P1新生鼠和P56成年鼠的海马区体积减小,海马区NSCs增殖减少,凋亡增加,且抑制NSCs向神经元的分化,促进向星形胶质细胞的分化。结论:4HBP孕期暴露损伤子代小鼠海马区NSCs功能和认知发育。第二部分内质网应激PERK-ATF4信号介导4HBP海马区发育毒性的分子机制目的:探索内质网应激PERK-ATF4信号介导4HBP海马区发育毒性的分子机制。方法:（1）分别对增殖和分化培养的原代海马区NSCs进行1μM 4HBP染毒,7天后收细胞进行转录组测序和生物信息分析,主要包括基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）和HALLMARK基因富集分析。（2）透射电子显微镜观察染毒新生鼠海马区和原代海马区NSCs的亚细胞超微结构变化。（3）收集4HBP体外染毒7天的原代海马区NSCs和4HBP孕期暴露的P1、P56子代鼠海马组织,采用Western blot和RT-q PCR技术探究4HBP暴露对原代海马区NSCs和子代海马组织内质网应激PERK-ATF4以及NFkB炎症反应信号的影响。（4）在原代海马区NSCs中,通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）、染色质免疫共沉淀以及双荧光素酶报告基因等方法揭示内质网应激PERK-ATF4通路激活NFkB-p65炎症信号的分子机制。结果:（1）转录组测序和生物信息分析发现,1μM 4HBP染毒后,增殖条件下原代海马区NSCs的差异表达基因为644个,而分化条件下的差异表达基因仅有152个,提示4HBP主要影响NSCs的增殖。基因富集分析发现,4HBP染毒主要激活内质网应激、NFkB介导的炎症信号以及细胞凋亡等信号通路。（2）透射电子显微镜结果显示,与对照组相比,孕期4HBP暴露的新生鼠海马组织和体外4HBP染毒的原代海马区NSCs的内质网边界不规则、体积膨胀,呈现出内质网肿大的形态,内质网周边细胞器（如核糖体）显著增加。（3）孕期4HBP暴露诱导P1和P56子代海马区组织PERK-ATF4信号通路上的关键蛋白PERK、p-e IF2a、ATF4、CHOP的表达量增加。同时,NFkB炎症反应信号通路亦被激活,其中p65蛋白和m RNA水平上升,Ik Ba蛋白和m RNA水平下降。（4）体外4HBP染毒诱导原代海马区NSCs PERK-ATF4信号通路激活,同时NFkB炎症反应信号通路亦被激活,其中p65蛋白和m RNA水平上升,Ik Ba蛋白和m RNA水平下降。此外,体外4HBP染毒后NSCs新生成的总蛋白明显减少。（5）ATF4敲低缓解了4HBP暴露诱导的p65蛋白和m RNA的表达上调及其核位移。此外,ATF4敲低缓解了4HBP暴露诱导的NSCs增殖减少、凋亡增加、细胞活力下降以及神经球生长受限。重要的是,染色质免疫共沉淀以及双荧光素酶报告基因检测实验发现ATF4可与p65启动子结合,在转录水平激活p65的表达,从而促进NFkB炎症信号。结论:内质网应激PERK-ATF4信号通过激活NFkB-p65炎症信号介导4HBP的神经发育毒性。第三部分抑制内质网应激PERK-ATF4信号改善4HBP诱导的神经发育损伤目的:通过小分子化合物抑制激活的PERK-ATF4信号,验证其对海马区发育与认知功能损伤的保护作用。方法:（1）原代NSCs:对增殖培养的NSCs进行1μM 4HBP染毒7天,同时给予0.5μM PERK抑制剂（PERK inhibitor,PERKi）。通过神经球动力学实验、免疫荧光染色、Western blot和RT-q PCR技术探究PERKi对4HBP染毒NSCs的保护作用。（2）孕鼠:将孕鼠分为四组:0.1%无水乙醇对照组、1 mg kg-1 day-1 4HBP暴露组、50 mg kg-1 day-1 PERKi对照组、PERKi干预组（4HBP与PERKi同时暴露）。分娩后在正常条件下继续饲养子代鼠至P56,进行认知行为学实验。进一步通过免疫荧光染色、Western blot和RT-q PCR技术探究PERKi干预对缓解孕期4HBP暴露诱导的神经发育毒性作用。（3）人源类脑器官:将人源诱导性多能干细胞在含有细胞外基质和特定生长因子的旋转生物反应器中诱导分化培养60天,形成类脑器官,培养期间进行染毒和PERKi干预。将类脑器官分为0.1%无水乙醇对照组、0.1μM 4HBP暴露组、0.1μM PERKi对照组、PERKi干预组。随后通过类脑器官动力学实验和免疫荧光染色实验探究PERKi干预对4HBP暴露诱导的类脑器官细胞凋亡以及p65激活的保护作用。结果:（1）抑制PERK信号改善了4HBP染毒诱导的NSCs凋亡、细胞活力下降和神经球生长受限。同时,4HBP染毒诱导的海马区原代NSCs PERK-ATF4、NFkBp65信号通路以及紊乱的蛋白合成稳态在PERKi处理后显著缓解。（2）水迷宫空间学习测试发现,因孕期4HBP暴露导致的子代寻找水下平台花费时间增加,在PERKi处理后显著降低;水迷宫记忆测试进一步发现,PERKi亦改善了4HBP染毒导致的水下平台所在象限游泳时间与穿过平台次数的减少。在T迷宫实验中,PERKi明显缓解了染毒子代自发交替行为减少的现象。（3）PERKi衰减了暴露子代海马区组织及原代NSCs中过度激活的PERK-ATF4和NFkB-p65信号。（4）与对照组相比,4HBP染毒导致类脑器官内部区域出现明显坏死,类脑器官中NSCs的增殖减弱、凋亡增加,p65蛋白表达升高并出现核定位增加。PERKi处理后显著改善了4HBP染毒诱导的类脑器官细胞凋亡,抑制了p65的激活和核位移。结论:抑制PERK-ATF4信号改善4HBP诱导的神经发育毒性。