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低温(Low Temperature,LT)是影响植物生长的最重要的因素之一。低温限制了植物的地理分布,降低了某些农作物的产量,缩短了植物的生长季节。一些重要的农作物(如棉花、大豆、玉米、水稻、西红柿),一些热带水果(如香蕉、番木瓜、芒果等)和亚热带水果(如葡萄、番石榴、橘子等)都是低温敏感型的,极易受到低温的伤害。每年因低温而导致的农作物的损失高达到数十亿美元。因此,挖掘新型抗寒基因并研究其抗寒功能,将抗寒基因应用在农作物上,提高农作物的抗寒能力,具有重要的理论及现实意义。
从南极鱼Lychodyichthys dearborni的肝脏的AFPⅢ的cDNA中克隆出一个含有4个抗冻蛋白结构域基因LD4；同时也从南极鱼Dissostichus mawsoni的cDNA文库中克隆出钙调素基因CaM。然后将这两个基因分别克隆到烟草表达载体pCAPE2和动物293T细胞表达载体pcDNA中。首先,通过磷酸钙共沉淀法将这两个基因分别转入到动物细胞293T中,然后对动物细胞进行4℃冷处理,探讨这两个基因在动物细胞中表达对短时间(20小时)低温的抗性。然后,再采用pEBV-VIGS病毒侵染技术,将融合基因转入到烟草中。并且运用RT—PCR来检测目的基因在烟草叶片中的表达情况。同时将转基因烟草和GFP对照组烟草4℃低温处理2周后,25℃室温恢复2周。通过测定烟草组织的细胞膜渗透率和膜脂过氧化产物丙二醛的含量变化来检测烟草受冷害的程度。主要结果如下:
1.从南极鱼Lycodichthys dearborni的肝脏中提取了一种AFPⅢ抗冻蛋白基因,并将该基因命名为LD12,LD12分子由12个串联重复的片段构成,从其克隆的pCMV-Script-LD12质粒中克隆出一个片段大小为0.888kb的具有四个重复片段的基因,并将其命名为LD4。同时,我们实验室从南极鱼Dissostichusmawsoni中克隆出一种低温条件下上调的基因-calmodulin,简称CaM。
2.将LD4或CaM基因分别转入到人肾上皮细胞-293T细胞中,在较短时间(约20小时)冷处理(4℃)之后,转LD4或CaM基因细胞的存活率较对照组分别要高31.2％或38.4％,结果显示这两种基因在动物细胞中具有一定的抗寒能力。
3.通过pEBV-VIGS病毒侵染技术,将LD4或CaM基因转入到烟草叶片中,常温(25℃)培养两周后对其进行冷处理(4℃)。在转基因烟草和对照组烟草冷胁迫2周后,发现转LD4或CaM组烟草与空载体阴性对照组烟草的表型有明显的差别。转LD4或CaM组烟草都呈现出少许的缺水情况,但是转空载体阴性对照组烟草的叶片有明显的萎焉和透明化的情况。低温处理2周的转基因烟草和对照组烟草在室温(25℃)条件下恢复2周后,转LD4或CaM组烟草都能继续生长,但是空载体阴性对照组烟草出现不可逆的死亡。结果显示转LD4或CaM组烟草中过量表达的外源基因LD4或CaM可以增强烟草组织对于冷胁迫的抗性。
4.冷胁迫2周后,转LD4或CaM烟草植株叶片的膜渗透率分别增加了14.4％或9.1％,而相对应的空质粒阴性对照组烟草分别增加了53.2％或39.0％；转LD4或CaM组烟草植株叶片丙二醛的含量分别增加了3.41倍或2.43倍,相对应的转空载体阴性对照组烟草增加了7.88倍或5.73倍。结果表明转空载体阴性对照组烟草受到冷胁迫的伤害比转LD4或CaM组烟草受冷胁迫的伤害要大。
综上所述,从南极鱼中克隆的抗寒基因CaM或抗冻蛋白基因LD4,在动物细胞中表达能增加其抗短期(20小时)低温胁迫的能力；而在烟草植株中超表达后则能够降低叶片组织在冷胁迫下所受的伤害,明显提高烟草的抗寒能力。有望进一步将这两个基因应用到提高农作物抗寒能力研究中。