中枢神经损伤后神经元无法再生,损伤平面以下运动,感觉及括约肌功能丧失。现有的治疗措施只能延缓脊髓损伤,无法逆转已损伤的神经组织。神经干细胞的发现为其治疗提供了一个全新的方向。神经干细胞具有增殖、自我更新和分化成神经细胞的能力,从而替代死亡的神经元,重建神经通路。但目前单纯神经干细胞移植由于缺乏细胞外基质的支持,其存活率和分化特性严重受到影响。而神经组织工程技术治疗脊髓损伤是现在研究的一个热点,本课题组拟通过神经球方法原代培养大鼠胚胎神经干细胞,并研究神经干细胞体外分化特性,利用培养的神经干细胞作为种子细胞和胶原凝胶生物支架一起构建神经干细胞三维培养模型,并检测胶原凝胶生物支架与神经干细胞的生物相容性,最后构建控释细胞因子的胶原凝胶生物支架,并观察其对神经干细胞的生物学影响。本研究共分为三个部分:在第一部分中,我们利用无血清悬浮培养的方法分离培养大鼠胚胎皮质来源的神经干细胞,用免疫荧光的方法检测神经干细胞及其分化细胞的标志物。结果显示体外无血清培养胎鼠皮质神经干细胞,可得到悬浮生长的神经球,但悬浮生长的神经球可以发生融合,免疫细胞化学显示神经球表达神经干细胞标志物巢蛋白,经过胎牛血清诱导后,神经干细胞可以分化为神经元,神经胶质细胞和少突胶质细胞,其中神经胶质细胞的分化比例最高。在第二部分中我们将神经干细胞与胶原凝胶进行三维培养构建神经干细胞三维培养模型,结果显示神经干细胞与胶原凝胶具有良好的生物相容性,胶原凝胶三维支架中的神经干细胞可以快速增殖并形成神经克隆球,这些神经克隆球可以被传代并且重新在悬浮培养体系中形成传统的神经球。胶原凝胶中的神经克隆球表达神经干细胞的特异性标志物巢蛋白,并且可以分化形成神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞。与悬浮培养的神经球相比,早期三维培养中形成的神经克隆球其分化为神经元的潜能更高,且三维培养中神经球突起长度明显长于贴壁分化组中神经球的长度。在第三部分中我们首先构建控释细胞因子的胶原凝胶支架,利用ELISA方法检测生物支架中细胞因子的释放曲线,结果显示胶原凝胶是良好的细胞因子控释载体支架,细胞因子在体外释放可达10天,控释细胞因子的胶原凝胶支架与神经干细胞共培养后,并分为共分为四组:A:复合BDNF-NT-3胶原凝胶组(实验组);B:复合BDNF胶原凝胶组(对照组);C:复合NT-3胶原凝胶组(实验组)D:胶原凝胶组(对照组)。利用CCK-8检测各培养组中的细胞活性,结果显示复合BDNF-NT-3胶原凝胶组中细胞活力要高于其他实验组,其中胶原凝胶组的细胞活力最低。随机选取各组20个神经球,同时利用DP71图像处理软件计算各组神经轴突的长度,结果显示复合BDNF-NT-3胶原凝胶组中神经突起的长度要长于其他各组。各组神经干细胞培养一周后,用1%的FBS诱导分化,结果显示各组神经干细胞均可分化为神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞,复合BDNF-NT-3胶原凝胶组分化的神经元比例最高,其中在复合BDNF-NT-3胶原凝胶组和复合BDNF胶原凝胶组中神经干细胞分化比例的顺序为神经元>神经胶质细胞>少突胶质细胞,在复合NT-3胶原凝胶组和胶原凝胶组中神经干细胞分化比例的顺序为神经胶质细胞>神经元>少突胶质细胞。综上所述,在无血清含有生长因子的培养条件下,利用神经球方法可以分离培养出胎鼠皮质神经干细胞,神经干细胞具有增殖和多向分化的能力。胶原凝胶与神经干细胞具有良好的生物相容性,可以提供神经干细胞生长所需要的三维环境,作为细胞因子控释的载体,不仅可以保护细胞因子的生物活性,还可以促进神经干细胞轴突生长和向神经元方向分化,多个细胞因子联合应用,其作用更为有效。