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目的
癫痫作为神经系统常见疾病之一,其发病机制十分复杂,目前仍未完全阐明。研究表明经典 MHCⅠ类分子作为重要的免疫分子其不仅在发育及成年中枢神经系统表达并发挥重要的非免疫学作用例如参与神经发育、调节突触可塑性等,且在一些神经系统疾病中异常表达并发挥一定功能。迄今为止,经典MHCⅠ类分子在癫痫中的表达及功能尚不清楚。因此,本研究旨在探究经典MHCⅠ类分子在癫痫中的表达、功能及可能的作用机制。
方法
首先利用Western Blot、免疫组化和免疫荧光探究人癫痫脑组织中经典MHCⅠ类分子的表达及临床意义;然后利用成年C57BL6/J野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠,建立海人酸(KA)诱导的小鼠癫痫模型,利用Western Blot检测MHCⅠ类分子在野生鼠癫痫模型急性期中的表达。比较野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠在KA诱导癫痫持续状态期间的行为学差异。收集癫痫急性期不同时间点的小鼠海马组织,利用Fluoro-Jade C(FJC)染色、免疫组化和RT-qPCR比较野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠癫痫急性期神经元变性和小胶质细胞改变的差异;最后利用Western Blot检测野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠生理条件下和癫痫急性期海马部位突触相关蛋白的表达来初步探究MHCⅠ类分子在KA诱导小鼠癫痫模型中的作用机制。
结果
1. 收集76例不同病理类型的难治性癫痫患者手术切除的脑组织石蜡标本及临床资料,14例手术切除新鲜脑组织及 6 例尸检对照新鲜脑组织。免疫组化和 Western Blot 结果显示经典MHCⅠ类分子在不同病理类型的难治性癫痫FCD各型及非特异性病变(NSL)的神经元和小胶质细胞中表达均上调,且该分子在神经元上的表达与其在小胶质细胞上的表达存在弱线性相关性。统计学分析进一步表明MHCⅠ类分子在神经元和小胶质细胞上的表达与癫痫发病持续时间和手术年龄间无线性相关性。免疫荧光双标结果显示除了表达在神经元和小胶质细胞上,经典MHCⅠ类分子还表达在发育异常的神经元上。
2. 利用成年 C57BL6/J 野生鼠和 MHCⅠ类分子基因敲除鼠,建立海人酸(KA)诱导的小鼠癫痫模型,收集癫痫急性期野生鼠海马组织,Western Blot结果显示经典MHCⅠ类分子在野生鼠癫痫模型急性期表达增加。
3. 利用Racines分级对小鼠行为学进行分析,行为学结果显示与野生鼠相比,MHCⅠ类分子基因敲除鼠癫痫持续状态期间癫痫发作程度较重,癫痫发作潜伏期缩短约 21.6%,致痫剂量减少约11.4%。
4. 利用FJC染色、免疫组化和RT-qPCR检测野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠KA诱导癫痫急性期神经元变性的情况和小胶质细胞的改变,结果显示野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠海马部位变性神经元数目、小胶质细胞数目及炎症因子mRNA表达均增加,且MHCⅠ类分子基因敲除鼠在各时间点比野生鼠增加的明显。
5. Western Blot结果显示与野生鼠相比,生理条件下MHCⅠ类分子基因敲除鼠海马部位突触相关蛋白Synapsin-1和VGluT1表达上调,而VGAT表达下调,VGluT1/VGAT比值增加, PSD95和Gephyrin表达没有变化。
6. Western Blot结果显示KA诱导癫痫急性期,野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠突触相关蛋白均出现相应的变化,MHCⅠ类分子基因敲除鼠Synapsin-1、VGluT1和PSD95的表达始终高于野生鼠,VGAT的表达始终低于野生鼠。
结论
1. 经典MHCⅠ类分子在癫痫病灶神经元和小胶质细胞上表达上调。
2. MHCⅠ类分子参与KA诱导的小鼠癫痫模型的发生发展,且该分子对KA诱导的神经元损伤具有保护作用,并调节小胶质细胞的增生和活化。
3. MHCⅠ类分子可能通过调节突触相关蛋白表达影响癫痫易感性及癫痫疾病的进展。本研究为阐明MHCⅠ类分子在癫痫中的功能及可能致病机制提供思路,有助于理解MHCⅠ类分子在神经系统疾病中的作用。
癫痫作为神经系统常见疾病之一,其发病机制十分复杂,目前仍未完全阐明。研究表明经典 MHCⅠ类分子作为重要的免疫分子其不仅在发育及成年中枢神经系统表达并发挥重要的非免疫学作用例如参与神经发育、调节突触可塑性等,且在一些神经系统疾病中异常表达并发挥一定功能。迄今为止,经典MHCⅠ类分子在癫痫中的表达及功能尚不清楚。因此,本研究旨在探究经典MHCⅠ类分子在癫痫中的表达、功能及可能的作用机制。
方法
首先利用Western Blot、免疫组化和免疫荧光探究人癫痫脑组织中经典MHCⅠ类分子的表达及临床意义;然后利用成年C57BL6/J野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠,建立海人酸(KA)诱导的小鼠癫痫模型,利用Western Blot检测MHCⅠ类分子在野生鼠癫痫模型急性期中的表达。比较野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠在KA诱导癫痫持续状态期间的行为学差异。收集癫痫急性期不同时间点的小鼠海马组织,利用Fluoro-Jade C(FJC)染色、免疫组化和RT-qPCR比较野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠癫痫急性期神经元变性和小胶质细胞改变的差异;最后利用Western Blot检测野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠生理条件下和癫痫急性期海马部位突触相关蛋白的表达来初步探究MHCⅠ类分子在KA诱导小鼠癫痫模型中的作用机制。
结果
1. 收集76例不同病理类型的难治性癫痫患者手术切除的脑组织石蜡标本及临床资料,14例手术切除新鲜脑组织及 6 例尸检对照新鲜脑组织。免疫组化和 Western Blot 结果显示经典MHCⅠ类分子在不同病理类型的难治性癫痫FCD各型及非特异性病变(NSL)的神经元和小胶质细胞中表达均上调,且该分子在神经元上的表达与其在小胶质细胞上的表达存在弱线性相关性。统计学分析进一步表明MHCⅠ类分子在神经元和小胶质细胞上的表达与癫痫发病持续时间和手术年龄间无线性相关性。免疫荧光双标结果显示除了表达在神经元和小胶质细胞上,经典MHCⅠ类分子还表达在发育异常的神经元上。
2. 利用成年 C57BL6/J 野生鼠和 MHCⅠ类分子基因敲除鼠,建立海人酸(KA)诱导的小鼠癫痫模型,收集癫痫急性期野生鼠海马组织,Western Blot结果显示经典MHCⅠ类分子在野生鼠癫痫模型急性期表达增加。
3. 利用Racines分级对小鼠行为学进行分析,行为学结果显示与野生鼠相比,MHCⅠ类分子基因敲除鼠癫痫持续状态期间癫痫发作程度较重,癫痫发作潜伏期缩短约 21.6%,致痫剂量减少约11.4%。
4. 利用FJC染色、免疫组化和RT-qPCR检测野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠KA诱导癫痫急性期神经元变性的情况和小胶质细胞的改变,结果显示野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠海马部位变性神经元数目、小胶质细胞数目及炎症因子mRNA表达均增加,且MHCⅠ类分子基因敲除鼠在各时间点比野生鼠增加的明显。
5. Western Blot结果显示与野生鼠相比,生理条件下MHCⅠ类分子基因敲除鼠海马部位突触相关蛋白Synapsin-1和VGluT1表达上调,而VGAT表达下调,VGluT1/VGAT比值增加, PSD95和Gephyrin表达没有变化。
6. Western Blot结果显示KA诱导癫痫急性期,野生鼠和MHCⅠ类分子基因敲除鼠突触相关蛋白均出现相应的变化,MHCⅠ类分子基因敲除鼠Synapsin-1、VGluT1和PSD95的表达始终高于野生鼠,VGAT的表达始终低于野生鼠。
结论
1. 经典MHCⅠ类分子在癫痫病灶神经元和小胶质细胞上表达上调。
2. MHCⅠ类分子参与KA诱导的小鼠癫痫模型的发生发展,且该分子对KA诱导的神经元损伤具有保护作用,并调节小胶质细胞的增生和活化。
3. MHCⅠ类分子可能通过调节突触相关蛋白表达影响癫痫易感性及癫痫疾病的进展。本研究为阐明MHCⅠ类分子在癫痫中的功能及可能致病机制提供思路,有助于理解MHCⅠ类分子在神经系统疾病中的作用。