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目的通过超速离心法从全骨髓贴壁培养的小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的上清培养液中提取外泌体(exosomes,Exo)对脑出血小鼠进行干预,通过Western-blot法,免疫组化法,以及动物行为学鉴定等手段阐明BMSCs来源的外泌体调节小鼠脑出血灶周围线粒体功能及对神经功能改善的影响。方法将6～8周雄性ICR小鼠随机分为3组每组15只:1)假手术组2)脑出血模型组3)外泌体干预组(2mg/kg)造模完成后打上对应耳标,常规饲养,并进行以下操作:1通过立体定位注射自体血对小鼠进行脑出血模型的建立。2通过全骨髓贴壁法提取幼龄小鼠BMSCs的原代并进行培养。3使用成脂,成软骨,成骨诱导骨髓间充质干细胞的并对其进行染色鉴定,使用流式细胞仪对第三代细胞进行表型进行鉴定。4通过使用改进的差速超速离心法对骨髓间充质干细胞来源的外泌体提取并使用透射电镜,粒径检测,以及蛋白免疫印迹法鉴定。5通过使用干湿比重法对实验动物进行脑水肿的检测。6 Morris水迷宫检测动物行为学的改变。7流式细胞仪检测线粒体Ros变化。8组织细胞线粒体膜电位检测。9组织ATP(adenosine triphosphate,ATP)水平测定。10 Western-blot法检测SPRR1A及GAP-43蛋白表达的影响。11免疫组化法检测SPRR1A(Small Proline Rich Protein1A,SPRR1A)及GAP-43(Growth associated protein-43,GAP-43)蛋白表达的影响。结果1鼠瘫痪侧前肢回收屈曲于腹下并伴有震颤,行走时有向瘫痪侧侧旋的体征,并伴有精神萎靡。模型鼠脑进行解剖后,对比左右两个脑半球,右侧充血严重,脑沟回消失,大脑水肿严重能够观察到血肿位于基底节区,周围有局部脑组织损伤2 BMSCs第一代胞体较小,第三代形状为圆形或梭型,折光强,呈涡旋状增长。3成骨诱导后茜素红染色呈现深度不同的红色,成软骨诱导后呈胞浆内出现蓝色沉淀。成脂肪诱导后脂肪滴液被油红O染色为深红色。流式细胞鉴定骨髓间充质干细胞PE-CD90+,PE-CD54-,FITC-CD29+,FITC-45-。4超速离心后电镜下沉淀物呈囊泡状有完整的茶托结构;CD9与CD63呈阳性表达,Calnexin呈阴性表达。运用Nano2000测定出外泌体浓度40ug/ul。5采用干湿比重法测定脑水肿发现假手术组脑组织含水量无明显变化。模型组在造模1,3,7天内脑组织的含水量均显著增高。治疗组1,3,7天内的脑组织含水量均低于模型组,差异显著。6模型组在伤后第7,14,21天搜索安全岛潜伏期明显比假手术组增加,差异显著。治疗组在伤后第14天,第21天搜索安全岛的潜伏期时间明显比假手术组缩短,差异显著。7将假手术组小鼠脑组织ROS值作为对照,模型组脑组织ROS量在第3天达到高峰峰值右偏,治疗组小鼠脑组织的ROS峰值比模型组峰值左偏,差异显著,提示经治疗后损伤有所改善。8将假手术组小鼠脑组织膜电位峰值作为对照,模型组的脑组织细胞线粒体膜电位峰值左偏低于假手术组,治疗组小鼠脑组织的细胞线粒体膜电位量峰值右偏高于于模型组,差异显著。9模型组的ATP显示损伤可以使脑部能量代谢降低,治疗组ATP含量比假手术组含量低,但高于模型组,且呈上升趋势。10 Western-blot法检测结果显示在外泌体移植术后第3天GAP-43表达,模型组较假手术组增高;治疗组与模型组比较,表达无明显差异。在外泌体移植术后第7,14,21天的观察时间点,可见GAP-43模型组、治疗组相比较假手术组表达增高;治疗组较模型组比较,GAP-43表达有明显升高。SPRR1A的表达在外泌体移植术后第3天SPRR1A表达,移植组较模型组均无统计学差异。在外泌体移植术后第7,14,21天的观察时间点模型组、治疗组较假手术组表达增高,均有统计学意义(P<0.05);治疗组较模型组比较,SPRR1A表达有明显升高。11免疫组化法法检测:在外泌体注射后可见GAP-43,SPRR1A的表达:染色后GAP-43,SPRR1A呈黄色或棕黄色,假手术组,模型组小鼠脑组织几乎没有阳性表达,染色评分较低;治疗组小鼠GAP-43,SPRR1A在神经元细胞胞浆阳性表达明显增加,染色评分增加,差异有统计学意义。结论1采用自体血注入法能成功建立ICR小鼠ICH模型,并通过行为学检测。骨髓间充质干细胞中通过改良版超速离心法成功分离出外泌体。经过滴鼻法注入外泌体对出血灶周围线粒体功能起到了一定的保护作用,通过对GAP-43,SPRR1A蛋白的检测证明其对神经损伤后的神经保护有一定的作用。图17幅;表8个;参93篇。