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研究目的氯酚是一类来源于工业、农业和林业的重要有机污染物,在自然环境以及生活环境,甚至体液中均能广泛地检测到它的存在。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（UGTs）是人体组织器官内催化II相结合反应的关键代谢酶,在机体内源性物质的代谢排泄过程中起着极其重要的作用。本研究旨在评估氯酚对二相代谢酶UGT活性的抑制效应,探究氯酚对体内UGTs介导的内源物质代谢的影响,试图从代谢毒理学角度阐明氯酚的相关毒性机制。研究方法本研究通过体外构建二相代谢酶UGT催化葡萄糖醛酸化反应的孵育体系,逐一地探讨氯酚对11种人体UGT单酶的抑制参数。其中以14种氯酚,包括2-氯苯酚（2-CP）、3-氯苯酚（3-CP）、4-氯苯酚（4-CP）、2-氨基-4氯苯酚（4C2AP）、3-甲基-4-氯苯酚（4C3MP）、2,4-二氯苯酚（2,4-DCP）、2,3,4-三氯苯酚（2,3,4-TCP）、2,4,5-三氯苯酚（2,4,5-TCP）、2,4,6-三氯苯酚（2,4,6-TCP）、3,4,5-三氯苯酚（3,4,5-TCP）、2,3,4,5-四氯苯酚（2,3,4,5-TECP）、2,3,4,6-四氯苯酚（2,3,4,6-TECP）、2,3,5,6-四氯苯酚（2,3,5,6-TECP）、五氯苯酚（PCP）为抑制剂,等量的二甲基亚砜（DMSO）作为实验的空白对照。使用4-甲基伞形酮（4-MU）作为UGT的非特异性催化底物,观测底物与辅酶因子结合形成的产物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷（4-MUG）的产量变化,计算在氯酚作用下UGT酶活性的残余率。利用超高效液相色谱（UPLC）技术定量测定产物,进而推断不同结构的氯酚对UGT的抑制参数和类型。通过体外体内外推法（IVIVE）模拟估计氯酚在体内造成抑制的最低阈值。使用计算机软件进行UGT的三维空间结构的模拟构建,进行氯酚分子与酶蛋白的分子对接,从空间构型上进一步评估分析相似结构2-CP、4-CP及4C3MP对UGTs抑制差异的原因,试图从疏水作用和氢键结合关系解释这种现象。结果大部分CPs对UGTs各亚型展现出明显的抑制作用,并且抑制程度超过80%,选取PCP作为代表性氯酚测定其对UGT1A6、UGT1A9和UGT2B7的半数抑制浓度(IC50),其中,PCP对UGT1A6,UGT1A9和UGT2B7的半数抑制浓度分别是0.33μM、0.24μM和31.31μM,PCP对UGT1A6、UGT1A9和UGT2B7的抑制效应为竞争型抑制,抑制常数（Ki）分别为0.18μM、0.01μM和5.37μM。这些结果均有利于我们从一个新的角度阐述氯酚暴露的危害。对4-CP,2,4-DCP及4C3MP的空间结构与UGT1A9进行分子对接,结果显示它们之间的结合自由能分别为-5.16kcal/mol、-5.38 kcal/mol和-5.42kcal/mol。即2.4-DCP>4-CP、4C3MP>4-CP,并且2.4-DCP及4C3MP与UGT1A9之间的疏水作用强于4-CP,分子对接结果与初筛中得到的结论一致,提示分子间疏水作用的强弱是影响抑制能力的重要因素。结论1.氯酚作为一类有着极其危害性的环境持久性有机污染物,对二相代谢酶UGTs有较强的广泛抑制作用,其抑制效应与氯原子数量及相关取代基团密切相关。研究发现,当2-CP苯环上添加一个氯原子形成2.4-DCP或者添加一个甲基形成4C3MP时,其抑制能力明显加强,本实验借助分子对接软件,从空间构型上探究氯酚对UGTs产生抑制差异的机制,推断很可能是疏水作用的强弱引起了抑制能力的不同,2-CP与UGT亚型间的结合自由能较后两者结合自由能更低,疏水作用更弱,进而抑制能力更弱。2.氯酚的浓度超过一定阈值时,会抑制UGT各亚型的活性,进而抑制其催化的相关物质的代谢。通过以[I]/Ki的比值大于0.1作为氯酚抑制内源性物质代谢的判断标准。以PCP作为代表性氯酚,测得其对UGT1A6、UGT1A9和UGT2B7产生体内抑制的阈值分别是0.018μM、0.001μM和0.537μM,提示日常生活中人们暴露剂量低于此阈值至关重要。