全身性炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)是因感染或非感染因素作用于机体而引发的失控的,自我持续放大和破坏性的全身性炎症反应,其导致的多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)至今仍是临床危重病患者死亡的主要原因[1，2]。虽然不同致病因素引发SIRS的机制不完全相同,但炎症发生至发展过程中细胞因子的级联放大效应是公认共同的重要机制和表现之一[3]。数十年中,研究者陆续对一系列重要的炎症因子展开了深入研究,但目前的成果可能只是揭开了这个复杂的炎症因子网络面纱的一角。高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1, HMGB1),上世纪末被发现是一种重要的炎症因子[4],目前认为其作为晚期炎症介质在全身炎症反应过程中起关键作用[5]。对HMGB1最初的认识是作为核因子直接与染色质或DNA结合调节基因转录调控,其后陆续发现其具有多种复杂的生物学功能,包括参与脑的发育和神经细胞生长、纤维蛋白溶酶原的活化、细胞迁移、肿瘤细胞转移、免疫细胞分化、组织损伤以及各种组织脏器的炎症反应等[6]。近几年对IMGB1的研究主要集中于其在全身炎症反应过程中的作用及其参与机制。致炎因素作用并激活单核/巨噬细胞后,细胞通过主动分泌的方式将HMGB1释放的细胞外；另一方面,损伤因素导致的细胞坏死后,也可以释放出大量HMGB1。这些HMGB1分子通过进一步激活单核巨噬细胞或内皮细胞等,导致大量炎症因子的释放和黏附分子的表达,参与包括脑、肺、胃肠道、关节、心脏等多种脏器的炎症损伤以及广泛的全身性炎症反应,特别是在晚期炎症反应过程中起重要作用[7]。研究证明,HMGB1可以刺激单核巨噬细胞释放包括IL-1β在内的多种炎症因子,参与细胞因子的级联放大反应[5]。尽管目前对于HMGB1参与炎症反应的作用机制已经有了一些认识,但仍有很多问题不清楚,特别是分泌到细胞外的HMGB1如何作用于效应细胞并引发下游反应。近年研究者们陆续发现晚期糖基化终未产物受体(receptor for advanced gly cation end products, RAGE), Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)4、TLR2等都可以作为HMGB1的细胞表面受体,介导一定的炎症反应功能。然而研究表明,阻断这些受体仍不能完全抑制HMGB1对细胞的作用,即细胞表面可能还存在其它受体或其它可能的信号转导方式。除了可以通过受体将信号传递到细胞内,早在1997年研究者就发现体外表达的HMGB1可以携带DNA载体进入哺乳动物细胞并使载体有效表达[11]。近年还有研究发现HMGB1与核酸物质结合后,可以在RAGE协助下进入细胞并激活细胞内受体[10]，。由此可见,HMGB1作用于细胞的信号传导过程非常复杂,可能通过多种方式激活细胞参与病理生理反应。白细胞介素1(interleukin-1, IL-1)β是白细胞介素家族重要成员之一,主要由活化的单核巨噬细胞产生,参与机体多种疾病过程,在急性和慢性炎症反应过程中都发挥重要作用[12,131。目前认为,IL-1p在细胞内合成并最终被释放到细胞外,两条信号通路可能参与了这个过程,即TLR信号通路与NLR信号通路协同作用的结果。首先,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等通过活化TLR信号通络,参与了细胞内IL-1β前体(pro-IL-1β)在细胞内的生成和表达；而细胞内核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor, NLR)的活化,导致炎症小体的组装和激活,进一步激活caspase-1,导致IL-1β的最终成熟和释放[14]。NLR是一种重要的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs),主要存在于细胞质中,感受来自病原微生物的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)(?)口受损或死亡细胞释放的损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),与其它蛋白共同组装成多分子信号复合物炎症小体(inflatomasome),活化半胱氨酸蛋白酶(caspase),导致炎症介质的表达和释放,引发炎症反应[15,16]。NLRP3参与形成的炎症小体是目前研究最多和最热点的一种炎症小体,多种致炎刺激可以使其组装和活化,包括感染性刺激细菌、病毒、细菌毒素等,非感染性物质如细胞外ATP、透明质酸、尿酸盐结晶、p淀粉样沉淀,以及外源性物质如吸入的二氧化硅、明矾、石棉等[17]。NLRP3炎症小体是由NLRP3.凋亡相关的斑点样蛋白(apoptosis-associated speck—like protein containing CARD,ASC)和caspase-1主要组成的多分子复合物,通过激活caspase-1,导致细胞释放IL-1β等炎症因子,并发生致炎性死亡caroptosis。Pyroptosis是一种特异性依赖于caspase-1活化的致炎性的细胞死亡形式,其形态学特征介于细胞凋亡和坏死之间,发生DNA断裂,细胞核皱缩,而细胞膜则肿胀破裂,细胞内容物释放到细胞外。发生pyroptosis的细胞可以释放炎症因子和细胞内容物,进一步扩大炎症反应[19]。NLRP3炎症小体的活化机制目前还不完全清楚,是近年的研究热点。研究表明多种分子机制可能参与了这一过程并彼此相互影响,包括依赖钾离子外流的机制,依赖细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)激活的机制,以及晶体物质通过破坏溶酶体导致组织蛋白酶B(cathepsin B)活化,最终激活caspase-1在不同病理情况下,可能某一种或多种机制共同参与相互协调调节了炎症小体的活化。巨噬细胞是HMGB1参与机体炎症反应的主要载体。一方面,在各种致炎因素作用下,主要由单核／巨噬细胞主动分泌大量HMGB1到细胞外；另一方面,巨噬细胞又是HMGB1最主要的靶细胞。在HMGB1作用下,巨噬细胞进一步被激活,产生和释放包括IL-1p在内的更多炎症因子。而我们目前还不清楚HMGB1是否可以激活炎症小体并活化caspase-1。另一方面,已经被证实的信号过程不能完全解释HMGB1对巨噬细胞的效应,因此其作用于巨噬细胞放大炎症反应的具体机制也并不明确。基于以上理论背景,我们将观察和研究HMGB1作用于巨噬细胞所产生的病理现象和细胞反应,并进一步深入探讨其作用机制以及最终对机体产生的后果。我们分离并体外培养小鼠的肺、腹腔和骨髓来源的巨噬细胞,利用酶联免疫吸附实验、蛋白酶活化荧光检测探针、流式细胞术等技术观察了HMGB1作用于细胞后对细胞内caspase-1活化、IL-1β释放和细胞pyroptosis的影响。另一方面,我们体外构建并表达纯化了增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)融合的HMGB1重组蛋白,利用多种荧光探针和共聚焦显微技术,通过荧光示踪和共定位研究HMGB1的内化路径。最后,我们利用多种信号分子抑制剂以及分离培养基因缺陷小鼠的巨噬细胞,研究蛋白内化与细胞炎症反应特别是caspase-1活化,IL-1p释放以及细胞pyroptosis的相关性。通过研究,我们证实了HMGB1蛋白作用于小鼠巨噬细胞后,可以导致细胞内caspase-1激活,IL-1p释放增加,大量细胞发生pyroptosis。进一步,我们发现并提出一个HMGB1通过被巨噬细胞内吞,介导上述一系列炎症反应的信号模型：HMGB1蛋白在作用于小鼠巨噬细胞后,在GTP酶发动蛋白(dynamin)的协助下,快速被细胞内吞；进入细胞的蛋白首先存在于内涵体中；3h左右,内涵体开始和细胞溶酶体发生融合,HMGB1蛋白进入到细胞溶酶体中；6h左右,在HMGB1作用下,细胞溶酶体开始发生破裂,溶酶体内容物释放的细胞质中,随着时间推移,破裂的溶酶体逐渐增多,同时随着溶酶体的破裂和内容物释放,依赖溶酶体的组织蛋白酶cathepsin B被释放到细胞质内并活化；活化的cathepsin B使炎症小体组装和激活,进一步激活蛋白水解酶caspase-1; caspase-1的活化导致炎症因子IL-1β等的释放增加,以及最终导致细胞发生致炎性死亡pyroptosis。此外我们还证实,细胞膜表面受体RAGE参与并介导了HMGB1被巨噬细胞内吞的过程。同时,我们实验发现cathepsin B的活化发生在HMGB1刺激细胞9h左右,12h之后检测到了caspase-1的显著激活、IL-1p的释放和细胞pyroptosis,表明该通路的激活发生在HMGB1作用于细胞的晚期(9h之后)。另一方面,在HMGB1作用巨噬细胞3h就可以检测到活化的caspase-1,在6h检测IL-1β释放增加,而此时cathepsin B并没有被明显激活。进一步研究证明,cathepsin B的特异性抑制剂CA074me可以抑制晚期caspase-1的活化,而对早期caspase-1的活化没有影响。以上结果表明,HMGB1刺激巨噬细胞后,在早期即可以引起炎症小体(?)—caspase-1-IL-1β通路的活化,而该通路不依赖于]HMGB1的内化和cathepsin B的激活。因此,HMGB1作用于小鼠巨噬细胞可能通过两种不同的机制分别介导了早期和晚期的caspase-1的活化和IL-1p的释放。HMGB1已被普遍公认是一种重要的炎症介质,特别是在重症炎症晚期起关键作用,目前也是临床上对抗重症休克和炎症反应的研究重点,未来必将有更多的临床研究工作转向这个蛋白。而现阶段人们对这个蛋白参与炎症反应的具体机制还有很多未知和困惑。我们发现HMGB1通过内化行为介导了晚期炎症反应,这回答了这个蛋白一直困扰我们的很多问题,并且提出一种崭新的介导炎症反应的细胞通路模式,相信这可以为进一步的临床研究提供更好的思路和切入点。